Drosofilia Quantificazione della giunzione neuromuscolare (NMJ): un metodo per valutare la morfologia e la funzione sinaptica

Overview

La giunzione neuromuscolare Drosophila (NMJ) è usata come modello per studiare la morfologia e la funzione delle sinapsi. Questo video descrive importanti caratteristiche che i ricercatori quantificano per caratterizzare la NMJ. Il protocollo di esempio illustra un software in grado di eseguire automaticamente la quantificazione.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Castells-Nobau et al., Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology, J. Vis. Exp. (2017).

1. Requisiti prima dell'elaborazione delle immagini

1. Eseguire drosophila preparazioni di libri aperti di terze larve errante instar (L3), come descritto in precedenza.
2. Co-immunolabel Drosophila NMJ terminali usando una combinazione di due marcatori: Dlg-1 o Hrp insieme a Brp per l'analisi con "Drosophila NMJ Morphometrics", e Syt o Csp insieme a Brp per l'analisi con "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics ".
   NOTA: Gli anticorpi della stessa specie possono essere combinati pre-etichettandone uno con un kit di coniugazione anticorpale come i kit di etichettatura Zenon Alexa.
3. Immagine terminali NMJ utilizzando un microscopio a scelta, ad esempio fluorescenza (con o senza ApoTome) o microscopia confocale.
   1. Acquisire uno stack di immagini a 2 canali del terminale NMJ.
      1. Regolare le impostazioni del microscopio in modo che il canale 1 acquisisca il terminale NMJ immunoetichettato con Dlg-1 (o Hrp, Syt, Csp) e canale 2 il terminale NMJ immunoetichettato con Brp.
      2. Facoltativamente, analizzare le immagini a un canale (di sinapsi immunomarcate con un singolo anticorpo) con le macro. Immagine NMJs immunoetichettata in modo univoco con Dlg-1 o Hrp per l'analisi con "Drosophila NMJ Morphometrics", o Syt o Csp per "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics ".
         NOTA: Non è possibile analizzare le sinapsi immunososteniate solo con anti-Brp.
   2. Esportare le immagini ottenute come singoli .tiff file. Invertire l'ordine del canale prima di eseguire le macro se non acquisite come indicato.

2. Requisiti software e installazione

1. Scarica le macro: "Drosophila NMJ Morphometrics" e"Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" dal seguente sito Web: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1.
2. Spostare il cursore nella cartella "Aggiornamento macro 1" e fare clic sull'opzione di visualizzazione "visualizza". Verrà visualizzato un elenco con il contenuto di questa cartella. La cartella contiene le macro "Drosophila NMJ Morphometrics" e "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
   NOTA: Entrambe le macro sono compatibili con fiji versioni 1.4, che è fornito anche nella stessa cartella. Le macro potrebbero non essere eseguite nelle versioni recenti. Si prega di utilizzare la versione 1.4 fornita. Non è problematico avviare questa versione, anche su computer con una versione fiji più recente disponibile.
3. Clicca su "Scarica tutto". Il contenuto della cartella verrà scaricato nel computer come file .zip file. Decomprimere il file scaricato.
4. Copiare i file Drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm e Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm Fiji.app/plugins/ directory. Quando si riavvia il programma, le macro verranno visualizzate nella parte inferiore del menu a discesa Plugins.

3. Eseguire la sottomacro "Converti in stack" per creare proiezioni Z e hyperstack delle immagini NMJ

1. Avviare l'interfaccia grafica selezionando Plugin sulla barra degli strumenti e scegliere "Drosophila NMJ Morphometrics" nel menu a discesa.
2. Definire l'impostazione "Stringa file univoca" nell'interfaccia grafica della macro.
   NOTA: Il software per microscopio utilizza una firma di identificazione per organizzare piani e canali durante la memorizzazione degli stack come singoli file .tiff'immagine. L'impostazione univoca della stringa di file immessa deve specificare la firma assegnata dal software al primo piano del primo canale (importante: è necessario indicare il piano più basso e il numero di canale).
3. Selezionare solo la sottomacro "Converti in stack" e fare clic su "OK" e selezionare la cartella in cui si trovano le immagini. Se è selezionata una directory principale con più sottocartelle, verranno elaborati tutti i singoli file '.tiff all'interno della directory principale e della sottocartella che corrispondono ai criteri univoci della stringa di file.
   1. Se lo stack z contiene un solo canale, selezionare la casella "Solo canale 1".
4. Si noti che verranno visualizzati due nuovi file per immagine NMJ, per impostazione predefinita stack_image_name e flatstack_image_name di controllo. Conservare solo questi stack e flatstack per ulteriori analisi. La .tiff di file può essere eliminata a questo punto, riducendo al minimo le capacità di archiviazione richieste ed evitando potenziali fonti di errore.

4. Eseguire la sottomacro "Definisci ROI" per delineare il terminale di interesse NMJ

1. Inizia l'interfaccia grafica di "Drosophila NMJ Morphometrics".
2. Selezionare solo la casella di controllo "Definisci ROI" e premere "OK" e selezionare la directory principale in cui sono memorizzate le immagini flatstack_name e premere "Seleziona". La sottomacro "Definisci ROI" esegue automaticamente ricerche in tutte le sottocartelle all'interno della directory principale selezionata.
3. All'apertura della prima proiezione, selezionate lo strumento "Selezioni a mano libera" sulla barra degli strumenti.
4. Utilizzando il mouse disegna una selezione che contiene esclusivamente il terminale di interesse NMJ completo e fai clic su "OK" nella finestra "Definisci terminale". La macro procederà con la proiezione successiva.
5. Delineare il ROI successivo e ripetere fino a definire tutte le ROI. Il file di immagine del ROI, denominato "roi_image_name", verrà memorizzato nella stessa directory dello stack generato in precedenza e delle immagini di proiezione per ciascuna delle immagini elaborate. L'output di questa sottomacro è un'immagine binaria del ROI in bianco su uno sfondo nero.

5. Eseguire la sottomacro "Analizza" per quantificare le funzionalità del terminale NMJ

1. Passare alla barra degli strumenti, selezionare "Plugin" e utilizzare:
   "Drosophila_NMJ_Morphometrics" quando si analizzano sinapsi immunoetichettate con anti-Dlg-1 o anti-Hrp (canale 1) insieme all'anti-Brp (canale 2), o"Drosophila_NMJ_Bouton_Morphometrics" quando si analizzano sinapsi immunoetichettate con anti-Siyt o anti-Csp (canale 1) insieme a Brp (canale 2).
   1. Quando si devono analizzare pile di immagini a un canale (il canale strutturale Dlg-1 o HRP per "Drosophila_NMJ_Morphometrics", o Syt o Csp per "Drosophila_NMJ__Bouton_Morphometrics"), selezionare la casella "Solo Canale 1".
2. Regolare la scala corrispondente alle immagini da analizzare.
   1. Se un pixel nell'immagine corrisponde a 2,5 μm, indicare Scale-Pixels = 1, Scale-Distance in μm = 2.5. Nel caso in cui entrambe le impostazioni siano lasciate a 0, l'area NMJ, il perimetro, la lunghezza e la lunghezza del ramo più lunga saranno espressi in numero di pixel.
3. Se necessario, modificare le impostazioni di analisi predefinite della macro. Eseguire le regolazioni solo se la sottomacro "Analizza" è stata eseguita in precedenza con risultati insoddisfacenti (vedere la fine di questa sezione e la sezione 6 per istruzioni su come ottimizzare le impostazioni).
4. Selezionare le caselle di controllo "Analizza" e "Attendi" e premere "OK".
   1. Selezionare la casella di controllo "Attendi" durante l'esecuzione della sottomaschera "Analizza" su immagini a 2 canali. In caso contrario, possono verificarsi errori nel conteggio delle zone attive a causa delle limitate capacità del computer.
5. All'apertura di una nuova finestra "Scegli directory", selezionare la directory in cui si trovano le immagini e premere "seleziona". La macro analizzerà tutte le immagini memorizzate nella directory principale e, se applicabile, le cartelle successive (utilizzando i tre file dall'esecuzione delle sottomacre precedenti: stack_image_name, flatstack_image_name e roi_image_name). La macro elabora ogni immagine singolarmente e consecutivamente. Questa situazione può richiedere diversi minuti per stack di immagini (a seconda della capacità del computer).
6. Dopo aver eseguono la macro, si noti che nella cartella parentale verrà creato un nuovo file di immagine denominato res_image_name per ogni sinapsi analizzata archiviata. Le misurazioni quantitative saranno memorizzate come file "risultati.txt".
7. Ispezionare tutte le immagini dei risultati per rilevare ed escludere le immagini con errori di segmentazione. I possibili errori di segmentazione sono descritti nella tabella 1, insieme a consigli su come regolare le impostazioni per aggirare questi errori. Le immagini dei risultati con tali errori di segmentazione vengono fornite come esempi nella figura 1.
   NOTA: Quando si esegue la macro con le impostazioni predefinite osservate nell'interfaccia utente, si è avuto un'accuratezza di circa il 95% quando la valutazione macro è stata confrontata con la valutazione manuale.

6. Regolare le impostazioni macro per le immagini

1. Quando più del 5% delle immagini mostra errori di segmentazione, esplora i diversi algoritmi per definire / scegliere le impostazioni macro più adatte per le immagini.
2. Regolare il valore del raggio della palla rotolante
   NOTA: La funzione raggio palla rotolante sottrae lo sfondo dell'immagine. Questa funzione è di fondamentale importanza quando si lavora con immagini acquisite su microscopi a fluorescenza e/o quando le immagini hanno un elevato rumore di fondo. La sottrazione dello sfondo aiuterà i passaggi di soglia automatica della macro a produrre un'adeguata segmentazione dei terminali NMJ.
   1. Selezionare tre immagini stack_image_name NMJ generate dalla sottomacro "Converti in stack". Scegliere le immagini rappresentative per il set di dati dell'immagine.
   2. Sulla barra degli strumenti selezionare Immagine | Colore | Dividi canali. Verranno creati due stack di immagini, uno che rappresenta rispettivamente il canale 1 e l'altro canale 2 e salvarli.
   3. Aprire la pila di immagini appartenente al canale 1 aperto, corrispondente all'immunoetichettatura Dlg-1, Hrp, Syt o Csp.
   4. Eseguire il filtro "Sottrai sfondo" selezionando "Processo" nella barra degli strumenti seguito da "Sottrai sfondo..." nel menu a discesa.
   5. Fare clic sulla casella di controllo anteprima nella finestra popup e regolare il raggio della palla rotolante sul valore più appropriato per le immagini. L'impostazione "Raggio palla rotolante" deve essere regolata in base a valori che aumentano il contrasto tra sinapsi e sfondo (cfr. figura 2A»).
      1. Per un esempio, vedere la figura 2. Nel pannello A, parti della sinapsi mostrano gli stessi livelli grigi dello sfondo, mentre nel pannello A della figura 2 un "raggio della palla rotolante" di 500 si traduce in un forte contrasto tra la sinapsi e lo sfondo.
   6. Creare una proiezione z selezionando nella barra degli strumenti Immagine | Pila| Proiezione Z, scegliere Tipo di proiezione = Intensità massima e salvare l'immagine risultante. Quando viene definito il valore appropriato per il raggio della palla rotolante, eseguire l'algoritmo "Sottrai sfondo" sulle immagini rappresentative rimanenti con lo stesso valore del raggio della palla rotolante. Create le proiezioni Z e salvatele (in qualsiasi directory).
      NOTA: Il valore del raggio della palla rotolante per le immagini a 8 bit o RGB deve essere grande almeno quanto il raggio dell'oggetto più grande nell'immagine che non fa parte dello sfondo. Per le immagini a 16 e 32 bit il raggio deve essere inversamente proporzionale all'intervallo di valori pixel.
3. Determinare le diverse soglie automatiche che verranno utilizzate
   1. Aprite le proiezioni Z salvate nel passaggio precedente (6.2.6) e selezionate Immagine (Select Image | Regolare | Proprietà AutoThreshold | Prova tutto.
   2. Poiché un'immagine di risultato con soglia binaria apparirà con tutti i diversi algoritmi di soglia automatica, determinare l'algoritmo più adatto per le immagini.
      1. Quando si esegue la macro in un secondo momento, modificare di conseguenza la soglia nelle impostazioni della macro.
      2. Usa soglie più restrittive come "RenyiEntrophy" o "Moments" come soglia di struttura NMJ e soglie più permissive come "Li" per determinare l'ossatura NMJ e "Huang" per determinare le zone attive. Quando le immagini sono molto nitide con poco o nessun sfondo, usa "Huang" come" soglia del contorno NMJ. In caso contrario, alcune parti della sinapsi potrebbero mancare dopo la segmentazione dell'immagine.
      3. Cfr. ad esempiola figura 2B. Un'adeguata segmentazione della sinapsi si ottiene con soglie automatiche evidenziate da caselle verdi. Alcuni esempi di soglie non adatte sono evidenziati da caselle rosse (selezionare le sinapsi ad alto ingrandimento). In quest'ultimo, entrambe le parti della sinapsi sono mancanti o parti dello sfondo sono incluse.
4. Determinare la dimensione massima delle piccole particelle
   NOTA: Questa funzione escluderà dall'analisi tutte le particelle rilevate dalla soglia del contorno NMJ e dalla soglia di scheletro che sono inferiori al valore definito nell'"impostazione delle particelle piccole". Questo valore è definito in pixel. Questa funzione funge da filtro antirrozione ed è molto utile quando nelle immagini ottenute sono presenti alti tassi di fondo non uniforme (come cristalli/polvere).
   1. Aprire le proiezioni Z salvate nel passaggio 6.2.6. e impostare la scala per rilevare il numero di pixel tramite Analizza | Imposta scala. Applicare le impostazioni seguenti: distanza in pixel = 1, distanza nota = 1, proporzioni pixel = 1, Unità di lunghezza = pixel e premere "OK". Fare clic sullo strumento "Selezione ovale" sulla barra degli strumenti.
   2. Usando il topo disegnare una selezione strettamente circostante singole particelle che sono presenti nell'immunostaining ma non appartengono alla NMJ. Premere CTRL+m per un utente Windows o cmd+m per gli utenti Mac. Si aprirà una finestra dei risultati che indica l'area delle particelle selezionate in numero di pixel.
   3. Ripetere il passaggio precedente più volte con diversi artefatti presenti nelle immagini per determinare la più grande area di particelle/artefatti contaminanti. Questo sarà il valore da impostare nell'impostazione quando si esegue la macro in un secondo momento. Quando si esegue la macro impostare la "Small Particles Size" come la più piccola dimensione delle particelle osservata pus un margine del 25%.
   4. Per un esempio, vedere lafigura 2D. Il cristallo più grande rilevato ha un'area di 112 pixel. L'impostazione "Piccole dimensioni delle particelle", durante l'elaborazione di questa immagine con la macro, deve essere impostata su 125 - 150.
5. Determinare la dimensione minima del bouton
   NOTA: Questa funzione escluderà dall'analisi tutti i bouton rilevati dalla soglia di struttura NMJ inferiori al valore definito. Questo valore è definito in pixel.
   1. Seguire gli stessi passaggi descritti nella sezione 6.4, ma in questo caso disegnare una selezione che circonda i più piccoli bouton presenti nel terminale NMJ. Scegli l'area più piccola corrispondente al bouton più piccolo di quelli misurati. Questo è il valore da impostare nell'impostazione delle dimensioni minime del bouton quando si esegue la macro in un secondo momento.
6. Definire il valore "Tolleranza al rumore Maxima"
   1. Per definire il valore "Trova tolleranza di disturbo massima" per la macro, aprite la pila Z del canale 2 salvata nella sezione 6.2.2.
   2. Passare alla scheda plug-in del menu di scelta rapida, selezionare Elabora | Massimo (3D) e quando viene visualizzato il maximum_image_name (che può richiedere alcuni minuti), chiudere lo stack di immagini originale.
   3. Selezionate il Maximum..._image_name (lo stack di immagini appena ottenuto) e selezionate Plugin | Processo | Minimo (3D), quando la nuova immagine Minimum of Maximum..._image_name apears chiude il massimo... _image_name stack.
   4. Sulla barra degli strumenti selezionare Elabora | Trova maxima.... Una nuova finestra "Trova maxima..." si aprirà. Fare clic sulla casella di controllo "Anteprima selezione punti..." e riempire la casella "Tolleranza disturbo" con l'impostazione di macro predefinita 50. I punti massimi saranno indicati nell'immagine come piccole croci.
      1. Aumentare il valore "Tolleranza al rumore" se si osserva un eccesso di zone attive annotate, o cioè incroci che non si trovano sopra le zone attive che non sono in fuoco sul piano dello stack selezionato o false zone attive rilevate in background.
         1. D'altra parte, se si osservano zone attive annotate in modo incompleto, cioè le zone attive a fuoco non riconosciute, diminuire il valore "Tolleranza al rumore Maxima". Continuare a provare valori diversi seguendo questa procedura fino a quando le croci non etichettano in modo appropriato le zone attive a fuoco. Riempire la "Trova tolleranza al rumore massima" con questo valore.
         2. Cfr. ad esempiola figura 2C. Vengono rilevate troppe zone attive. Nella figura 2C vengono rilevate solo le zone attive a fuoco quando si aumenta il valore di "tolleranza al rumore Maxima".
   5. Eseguire la sottomacro "Analizza" per le immagini rappresentative selezionate nel passaggio 5.1, con le impostazioni definite in tutti i passaggi precedenti.
7. Regolare la soglia brp-puncta inferiore e superiore
   1. Si noti che dopo l'esecuzione della macro verrà visualizzato un nuovo file in base al passaggio 6.6, denominato 2_active_zone_stack_image_name. In questo stack di immagini le zone attive rilevate dalla funzione "Trova massimi" sono indicate da punti bianchi in ogni piano.
   2. Aprire il file trascinandolo e rilasciandolo sulla barra degli strumenti e selezionare Immagine | Impila | Progetto Z | Tipo di proiezione = Sezioni somma. Si oserà 2_active_zone_stack_image_name una proiezione del mercato.
   3. Selezionare Immagine | Regolare | soglia. Si aprirà una nuova finestra "Soglia". Far scorrere la barra superiore per scegliere un valore di soglia in cui vengono visualizzato in rosso tutti i punti positivi ai fuochi/Brp desiderati.
      NOTA: Se la soglia è impostata su un valore troppo basso, verrà conteggiato un eccesso di zone attive. Se impostato su un valore troppo alto, una frazione delle zone attive verrà persa.
      1. Cfr. ad esempiola figura 2E. Quando la soglia è impostata su 400, la maggior parte delle zone attive (simboleggiate come focolai da 1 pixel) non sono incluse nella segmentazione, poiché non sono evidenziate in rosso (Figura 2E). Quando la soglia è impostata su un valore pari a 50, tutte le zone attive sono evidenziate in rosso (Figura 2E').
   4. Definire questo valore come soglia minima. Lasciare "Soglia puncta superiore" sul valore massimo.
   5. Eseguire di nuovo la sottomacro "Analizza" per le immagini rappresentative con le impostazioni definite in tutti i passaggi precedenti di questa sezione. Valutare criticamente i file di immagine risultanti e assicurarsi che la segmentazione sia eseguita correttamente. In caso contrario, riadattare le impostazioni in base alla natura degli errori di segmentazione (Figura 1, Tabella 1).

Representative Results

Figura 1: Esempi di risultati di segmentazione macro inappropriati. Immagini dei risultati dopo aver eseguono "Drosophila NMJ Morphometrics" o "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics". Parti del terminale sinaptico non sono incluse nel contorno giallo (A). Parti dello sfondo sono incluse nel terminale sinaptico dal contorno giallo (B). La linea dello scheletro blu si estende oltre il terminale sinaptico (C - D). Vengono rilevate troppe zone attive (E - E'). Alcune zone attive non sono rilevate dall'analisi(G - G»). Le zone attive vengono rilevate al di fuori della sinapsi (F). Segmentazione del bouton non corretta (applicabile solo quando si esegue Drosophila NMJ Bouton Morphometrics), i bouton vengono persi (H) o troppi bouton vengono rilevati dalla segmentazione (I). Particelle come cristalli o polveri che fanno parte dello sfondo sono incluse nella segmentazione (J). Le informazioni su come modificare le impostazioni per evitare questi errori sono disponibili nella tabella 1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Esempi di regolazioni delle macro-impostazione e delle loro conseguenze per la segmentazione dell'immagine. (A) Sottrarre l'anteprima di sfondo di una sinapsi immunoetichettata Dlg-1, immagine su un microscopio a fluorescenza con ApoTome, quando "Raggio della palla rotolante" è impostato su 20 (A) o 500 (A'). (B) Immagini di output ottenute dopo l'esecuzione di Image | Regolare | Soglia automatica | Prova tutte le immagini che illustrano le segmentazioni delle immagini ottenute dai 16 diversi algoritmi di soglia automatica. (C) Anteprima "Trova Massimi" quando si imposta "Tolleranza al rumore" a 50 (C) e 500 (C'); Le zone attive rilevate dalla segmentazione sono etichettate da una piccola croce. (D) Misurazione delle "piccole particelle" che appaiono sullo sfondo dell'immagine di una sinapsi immunoetichettata con anti-Hrp, immagine su un microscopio confocale. (E) Proiezione "Sum slices" ottenuta dal 2_active_zone_stack_ima-ge_name. La soglia è fissata a 400 (E) e a 50 (E'). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

segmentazione	Errori osservati	esempio	Regolazioni necessarie
Area e perimetro NMJ (Rappresentato dal contorno giallo nell'immagine del risultato)	Parti del terminale sinaptico non sono incluse nel contorno giallo o parti dello sfondo sono inclusi nel terminale sinaptico delineato in giallo.	Figura 2A-B	Regolare il valore 'Raggio palla rotolante'. Cfr. sezione 6.1.	Regolare 'Soglia struttura NMJ'. Cfr. sezione 6.2.
Parametri correlati alla lunghezza NMJ (Rappresentato dalla linea di ossatura blu nell'immagine dei risultati)	La linea di ossatura blu si estende oltre o non è presente lungo l'intero terminale sinaptico.	Figura 2C-D	Regolare il valore 'Raggio palla rotolante'. Cfr. sezione 6.1.	Regolare 'Soglia struttura NMJ'. Cfr. sezione 6.2.
Puncta brp-positiva (Rappresentato da punti nell'immagine dei risultati)	Vengono rilevate troppe zone attive.	Figura 2E-E'	Diminuire il valore 'Trova tolleranza di disturbo massima'. Cfr. sezione 6.5.
Puncta brp-positiva (Rappresentato da punti nell'immagine dei risultati)	Le zone attive vengono perse dall'analisi.	Figura 2G-G'	Aumentare il valore 'Trova tolleranza al rumore massima'. Cfr. sezione 6.5.	Diminuire 'Soglia inferiore Brp-puncta'. Cfr. sezione 6.6.
Puncta brp-positiva (Rappresentato da punti nell'immagine dei risultati)	Vengono rilevati artefatti della zona attiva al di fuori del terminale sinaptico.	Figura 2F	Regolare la sezione 'Soglia zona attiva' 6.2.	Aumentare 'Soglia inferiore Brp-puncta'. Cfr. sezione 6.6.
Piccole particelle	Particelle come cristalli o polvere che fanno parte dello sfondo sembrano essere inclusi in segmentazione.	Figura 2J	Selezionare la casella 'Rimuovi piccole particelle'. Cfr. sezione 6.3.	Determinare le piccole particelle di dimensioni massime. Cfr. sezione 6.3.
Segmentazione di Bouton	Segmentazione bouton errata (Applicabile solo alla Drosophila NMJ Bouton Morphometrics; non utilizzare drosophila NMJ Morphometrics per la segmentazione bouton).	Figura 2H-I	Regolare 'Soglia struttura NMJ'. Cfr. sezione 6.1.	Determinare la "dimensione minima del bouton". Cfr. sezione 6.4.

Tabella 1: Guida alla risoluzione dei problemi relativi ai diversi tipi di errori nella segmentazione delle immagini che possono essere prodotti dalle macro. In questa tabella vengono descritti diversi tipi di errori di segmentazione delle immagini prodotti dalle macro. Questi possono essere facilmente rilevati nelle immagini dei risultati. Esempi di ogni tipo di errore sono riportati nella figura 1. Nella "sezione regolazioni" della tabella vengono evidenziate le impostazioni che devono essere regolate e all'utente viene fatto riferimento al sotto-passaggio critico della sezione 6, che descrive come regolare queste impostazioni.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining			Dilution
Mouse anti-discs large 1	Developmental Studies Hybridoma Bank	AFFN-DLG1-4D6	1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Rabbit anti-horseradish peroxidase	Jackson IR	323-005-021	1/500
Rabbit anti-Synaptotagmin	Gift from Hugo Bellen		Jan-00
Mouse anti-Cysteine string protein	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCSP-1(ab49)	1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Mouse anti-Bruchpilot	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Jan-50
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Life technologies	A11029	1/200
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568	Life technologies	A11011	1/500
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit	ThermoFisher	Z25006
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36930
Equipment
Confocal microscope or fluorescence microscope	Leica SP5
Zeiss Axio imager
Computer	Mac or Pc
Software
FIJI