Drosophila Neuromuskulært kryds (NMJ) Kvantificering: En metode til vurdering af synaptisk morfologi og funktion

Overview

Den Drosophila neuromuskulære krydset (NMJ) bruges som en model til at studere morfologi og funktion af synapser. Denne video beskriver vigtige funktioner, som forskere kvantificerer for at karakterisere NMJ. Eksempelprotokollen demonstrerer en software, der er i stand til at udføre kvantificeringen automatisk.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Castells-Nobau et al.,To algoritmer til høj overførselshastighed og multiparametrisk kvantificering af Drosophila Neuromuskulær Junction Morphology, J. Vis. Exp. (2017).

1. Krav forud for billedbehandling

1. Udfør Drosophila åbne bogforberedelser af tredje instar vandrende larver (L3), som tidligere beskrevet.
2. Co-immunolabel Drosophila NMJ terminaler ved hjælp af en kombination af to markører: Dlg-1 eller Hrp sammen med Brp til analyse med "Drosophila NMJ Morphometrics", og Syt eller Csp sammen med Brp til analyse med "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics ".
   BEMÆRK: Antistoffer fra samme art kan kombineres ved at formærke et med et antistof-bøjningssæt som Zenon Alexa Labeling Kits.
3. Image NMJ-terminaler ved hjælp af et mikroskop efter eget valg, f.eks. fluorescens (med eller uden ApoTome) eller konfokal mikroskopi.
   1. Anskaf en 2-kanals billedstak af NMJ-terminalen.
      1. Juster mikroskopindstillingerne på en måde, som kanal 1 erhverver NMJ terminal immunolabeled med Dlg-1 (eller Hrp, Syt, Csp) og kanal 2 NMJ terminal immunolabeled med Brp.
      2. Du kan også analysere billeder med én kanal (af synapser immunolabeled med et enkelt antistof) med makroerne. Image NMJs immunolabeled unikt med Dlg-1 eller Hrp til analyse med "Drosophila NMJ Morphometrics", eller Syt eller Csp for "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics ".
         BEMÆRK: Det er ikke muligt at analysere synapser immunostained med kun anti-Brp.
   2. Eksporter de hentede billeder som individuelle .tiff filer. Inverter kanalrækkefølgen, før makroerne afspilles, hvis de ikke hentes som angivet.

2. Softwarekrav og -installation

1. Download makroerne:"Drosophila NMJ Morphometrics" og"Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" fra følgende hjemmeside: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1.
2. Flyt markøren til mappen "Macros update 1", og klik på den viste indstilling "view". Der vises en liste med indholdet af denne mappe. Mappen indeholder makroerne "Drosophila NMJ Morphometrics" og"Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
   BEMÆRK: Begge makroer er kompatible med Fiji version 1.4, som også findes i den samme mappe. Makroerne kan muligvis ikke køre på de seneste versioner. Brug venligst den medfølgende version 1.4. Det er uproblematisk at starte denne version, selv på computere med en nyere Fiji-version tilgængelig.
3. Klik på "Download alle". Mappeindholdet hentes til computeren som en .zip fil. Udpak den hentede fil.
4. Kopier filerne Drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm og Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm til Fiji.app/plugins/ mappe. Når du genstarter programmet, vises makroerne nederst i rullemenuen Plugins.

3. Kør undermakroen "Konverter til stak" for at oprette Z-fremskrivninger og hyperstacks af NMJ Images

1. Start den grafiske grænseflade ved at vælge Plugins på værktøjslinjen, og vælg"Drosophila NMJ Morphometrics" i rullemenuen.
2. Definer indstillingen "Entydig filstreng" i makroens grafiske brugergrænseflade.
   BEMÆRK: Mikroskopet software bruger en identifikation signatur til at organisere fly og kanaler, når du gemmer stakke som individuelle '.tiff filer. Den indtastede entydige filstrengsindstilling skal angive den signatur, som softwaren har tildelt det første plan i den første kanal (vigtigt: laveste plan- og kanalnummer skal angives).
3. Marker kun undermakroen "Konverter til stak", klik på "ok", og vælg den mappe, hvor billederne er placeret. Hvis der er valgt en hovedmappe med flere undermapper, behandles alle individuelle '.tiff filer i hovedmappen og undermappen, der opfylder de entydige filstrengkriterier.
   1. Hvis z-stakken kun indeholder én kanal, skal du markere feltet "Kun Kanal 1".
4. Bemærk, at der vises to nye filer pr. NMJ-billede, der som standard kaldes stack_image_name og flatstack_image_name. Gem kun disse stakke og flatstack til yderligere analyse. Den .tiff filserie kan slettes på dette tidspunkt, hvilket minimerer den nødvendige lagerkapacitet og undgår potentielle fejlkilder.

4. Kør undermakroen "Definer INVESTERINGSAFKAST" for at afgrænse NMJ-interesseterminalen

1. Start den grafiske grænseflade af"Drosophila NMJ Morphometrics".
2. Marker kun afkrydsningsfeltet "Definer investeringsafkast", og tryk på "OK", og vælg den hovedmappe, hvor billederne med titlen flatstack_name gemmes, og tryk på "Vælg". Undermakroen "Definer investeringsafkast" søger automatisk gennem alle undermapper i den valgte hovedmappe.
3. Når den første projektion åbnes, skal du vælge værktøjet "Frihåndsmarkeringer" på værktøjslinjen.
4. Brug musen til at tegne et valg, der udelukkende indeholder den komplette NMJ-terminal af interesse, og klik på "OK" i vinduet "Definer terminal". Makroen fortsætter med den næste projektion.
5. Afskræns det næste investeringsafkast, og gentag det, indtil alle ROI'er er defineret. ROI-billedfilen med navnet "roi_image_name" gemmes i samme mappe som de tidligere genererede stak- og projektionsbilleder for hvert af de behandlede billeder. Outputtet af denne undermakro er et binært billede af investeringsafkastet i hvidt på en sort baggrund.

5. Kør undermakroen "Analyze" for at kvantificere NMJ Terminal Features

1. Gå til værktøjslinjen, vælg "Plugins", og brug:
   "Drosophila_NMJ_Morphometrics", når man analyserer synapser immunolabeled med anti-Dlg-1 eller anti-Hrp (kanal 1) sammen med anti-Brp (kanal 2), eller "Drosophila_NMJ_Bouton_Morphometrics", når man analyserer synapser immunolabeled med anti-Syt eller anti-Csp (kanal 1) sammen med Brp (kanal 2).
   1. Når en kanal billedstakke skal analyseres (den strukturelle kanal Dlg-1 eller HRP for "Drosophila_NMJ_Morphometrics", eller Syt eller Csp for "Drosophila_NMJ__Bouton_Morphometrics"), skal du vælge boksen "Kun Kanal 1".
2. Juster den skala, der svarer til de billeder, der skal analyseres.
   1. Hvis en pixel i billedet svarer til 2,5 μm, skal du angive Skalapixel = 1, Skalaafstand i μm = 2,5. Hvis begge indstillinger er tilbage ved 0, udtrykkes NMJ-området, omkredsen, længden og den længste grenlængde i antal pixel.
3. Juster om nødvendigt standardanalyseindstillingerne for makroen. Udfør kun justeringer, hvis undermakroen "Analyser" tidligere er blevet kørt med utilfredsstillende resultater (se slutningen af dette afsnit og afsnit 6 for at få vejledning i, hvordan du optimerer indstillingerne).
4. Marker afkrydsningsfelterne "Analyser" og "Vent", og tryk på "OK".
   1. Markér afkrydsningsfeltet "Vent", når du kører undermakroen "Analyser" på 2 kanalbilleder. Ellers kan der opstå fejl i aktiv zoneoptælling på grund af begrænset computerkapacitet.
5. Når et nyt vindue "Vælg en mappe" åbnes, skal du vælge den mappe, hvor billederne er placeret, og trykke på "vælg". Makroen analyserer alle billeder, der er gemt i hovedmappen og, hvis det er relevant, efterfølgende mapper (ved hjælp af de tre filer fra at udføre de tidligere undermakroer: stack_image_name, flatstack_image_name og roi_image_name). Makroen behandler hvert billede individuelt og fortløbende. Dette kan tage flere minutter pr. billedstak (afhængigt af computerens kapacitet).
6. Når du har afspilet makroen, skal du være opmærksom på, at der oprettes en ny billedfil med navnet res_image_name for hver analyseret synapse, der er gemt, i forældremappen. De kvantitative målinger gemmes som "results.txt"-fil.
7. Undersøg alle resultatbilleder for at registrere og udelade billeder med segmenteringsfejl. Mulige segmenteringsfejl er beskrevet i tabel 1sammen med råd om, hvordan du justerer indstillingerne for at omgå disse fejl. Resultatbilleder med sådanne segmenteringsfejl findes som eksempler i figur 1.
   BEMÆRK: Når makroen afspilles med de standardindstillinger, der er observeret i brugergrænsefladen, var der en nøjagtighed på ca. 95 %, da makrovurderingen blev sammenlignet med manuel evaluering.

6. Juster makroindstillingerne til billederne

1. Når mere end 5% af billederne viser segmenteringsfejl, skal du udforske de forskellige algoritmer for at definere / vælge de mest egnede makroindstillinger for billederne.
2. Juster værdi for rullekugleradius
   BEMÆRK: Funktionen rullekugleradius trækker billedets baggrund fra. Denne funktion er af afgørende betydning, når du arbejder med billeder erhvervet på fluorescensmikroskoper og/eller når billeder har høj baggrundsstøj. Fratrækkelsen af baggrunden vil hjælpe makroens automatiske tærskeltrin med at producere tilstrækkelig segmentering af NMJ-terminalerne.
   1. Vælg tre NMJ-stack_image_name billeder, der er genereret af undermakroen "Konverter til stak". Vælg billeder, der er repræsentative for billeddatasættet.
   2. Vælg Billede | Farve | Opdel kanaler. Der oprettes to billedstakke, hvoraf den ene repræsenterer henholdsvis kanal 1 og den anden kanal 2 og gemmer dem.
   3. Åbn billedstakken, der tilhører kanal 1 åben, svarende til Dlg-1, Hrp, Syt eller Csp immunolabeling.
   4. Kør filteret "Subtraher baggrund" ved at vælge "Proces" på værktøjslinjen efterfulgt af "Træk baggrund fra..." i rullemenuen.
   5. Klik på eksempelafkrydsningsfeltet i pop op-vinduet, og juster rullekugleradiussen til den værdi, der passer bedst til billederne. Indstillingen "Rullekugleradius" skal justeres til værdier, der øger kontrasten mellem synapse og baggrund (se figur 2A').
      1. Se figur 2 for et eksempel. I panel A viser dele af synapsen de samme grå niveauer som baggrunden, mens en "Rolling ball radius" på 500 i figur 2 panel A resulterer i stærk kontrast mellem synapsen og baggrunden.
   6. Opret en z-projektion ved at markere | på værktøjslinjen Billede Stak| Z-projektion, skal du vælge Projektion type = Max Intensitet og gemme det resulterende billede. Når den relevante værdi for rullekugleradius er defineret, skal du køre algoritmen "Subtraher baggrund" på de resterende repræsentative billeder med samme radiusværdi for rullekugler. Opret Z-fremskrivningerne, og gem dem (i en hvilken som helst mappe).
      BEMÆRK: Radiusværdien for rullekuglen for 8-bit eller RGB-billeder skal være mindst lige så stor som radius for det største objekt i billedet, der ikke er en del af baggrunden. For 16-bit og 32-bit billeder skal radius være omvendt proportional med pixelværdiområdet.
3. Fastlæg de forskellige automatiske tærskler, der skal bruges
   1. Åbn de Z-fremskrivninger, der blev gemt i forrige trin (6.2.6), og vælg Billede | Juster | AutoThreshold | Prøv alt.
   2. Som en binær tærskel resultat billede vises med alle de forskellige auto-tærskel algoritmer, bestemme den mest egnede algoritme til billederne.
      1. Når makroen afspilles senere, skal du ændre tærsklen i makroindstillingerne i overensstemmelse hermed.
      2. Brug mere restriktive tærskler som "RenyiEntrophy" eller "Moments" som NMJ-dispositionstærsklen og mere eftergivende tærskler som "Li" til at bestemme NMJ-skelettet og "Huang" til at bestemme aktive zoner. Når billederne er meget skarpe med lidt at ingen baggrund, skal du bruge "Huang" som " NMJ skitse tærskel. Ellers mangler dele af synapsen muligvis efter billedsegmentering.
      3. Se figur 2B for eksempel. Passende segmentering af synapsen opnås med automatiske tærskler fremhævet af grønne bokse. Nogle eksempler på ikke-egnede tærskler fremhæves med røde bokse (afkrydsningsfeltsynapser ved høj forstørrelse). I sidstnævnte mangler enten dele af synapsen, eller dele af baggrunden er inkluderet.
4. Bestem den maksimale størrelse af de små partikler
   BEMÆRK: Denne funktion udelukker alle partikler, der registreres af NMJ-konturtærsklen og skelettets tærskel, som er mindre end den definerede værdi i indstillingen "små partikler" fra analysen. Denne værdi er defineret i pixel. Denne funktion fungerer som et støjfilter og er meget nyttig, når der er høje ikke-ensartede baggrunde (såsom krystaller / støv) i de opnåede billeder.
   1. Åbn de Z-fremskrivninger, der blev gemt i trin 6.2.6. og indstille skalaen til at registrere antallet af pixel via Analyser | Angiv skala. Anvend følgende indstillinger: afstand i pixel = 1, kendt afstand = 1, pixelstørrelsesforhold = 1, Længdeenhed = pixel, og tryk på "Ok". Klik på værktøjet "Oval selection" på værktøjslinjen.
   2. Brug musen tegne et udvalg tæt omkring enkelte partikler, der er til stede i immunostaining, men ikke hører til NMJ. Tryk på Ctrl+m for en Windows-bruger eller cmd+m for Mac-brugere. Der åbnes et resultatvindue, der angiver arealet af de partikler, der er valgt i antal pixel.
   3. Gentag det foregående trin flere gange med flere artefakter til stede i billederne for at bestemme det største forurenende partikel / artefaktområde. Dette vil være den værdi, der skal angives i indstillingen, når makroen afspilles senere. Når du kører makroen indstille "Små partikler Størrelse" som den mindste partikelstørrelse observeret pus en margen på 25%.
   4. Se figur 2D for eksempel. Den største krystal opdaget har et areal på 112 pixels. Indstillingen "Lille partikelstørrelse", når dette billede behandles med makroen, skal indstilles til 125 - 150.
5. Bestem minimum bouton størrelse
   BEMÆRK: Denne funktion udelukker alle kampe, der er registreret af NMJ-dispositionstærsklen, og som er mindre end den definerede værdi, fra analysen. Denne værdi er defineret i pixel.
   1. Følg de samme trin som beskrevet i afsnit 6.4, men tegn i dette tilfælde et udvalg omkring de mindste boutons, der er til stede i NMJ-terminalen. Vælg det mindste område, der svarer til den mindste bouton af de målte. Dette er den værdi, der skal angives i minimumindstillingen for boutonstørrelse, når makroen afspilles senere.
6. Definer værdien "Maxima støjtolerance"
   1. Hvis du vil definere værdien "Find maxima støjtolerance" for makroen, skal du åbne kanal 2 Z-stakken, der er gemt i afsnit 6.2.2.
   2. Gå til fanen Plugins i pop op-menuen, vælg Behandl | Maksimum(3D), og når maximum_image_name vises (hvilket kan tage et par minutter), skal du lukke den oprindelige billedstak.
   3. Vælg Maximum..._image_name (den nyligt hentede billedstak), og vælg Plugins | Behandl | Minimum (3D), når det nye billede Minimum på Maximum..._image_name apears lukke Maximum ... _image_name stakken.
   4. Vælg Proces | Find maxima.... Et nyt vindue "Find maxima..." vil åbne. Klik på afkrydsningsfeltet "Valg af eksempelpunkt..." og udfyld boksen "Støjtolerance" med standardmakroindstillingen 50. Maxima-punkterne vil blive angivet i billedet som små kryds.
      1. Forøg værdien "Støjtolerance", hvis du observerer et overskud af kommenterede aktive zoner, dvs. krydser, der ikke er oven på aktive zoner, der ikke er i fokus på det valgte stakplan, eller falske aktive zoner, der registreres i baggrunden.
         1. På den anden side, hvis observere ufuldstændigt kommenterede aktive zoner, dvs aktive zoner i fokus ikke genkendes, mindske "Maxima støjtolerance" værdi. Fortsæt med at prøve forskellige værdier efter denne procedure, indtil korsene er korrekt mærkning aktive zoner i fokus. Fyld "Find maxima støjtolerance" med denne værdi.
         2. Se figur 2C for eksempel. Der registreres for mange aktive zoner. I figur 2C' registreres kun de aktive zoner i fokus, når værdien "Maxima støjtolerance" øges.
   5. Kør undermakroen "Analyser" for de repræsentative billeder, der blev valgt i trin 5.1, med de indstillinger, der er defineret i alle de foregående trin.
7. Juster Brp-punktncta lavere og øvre tærskel
   1. Bemærk, at der vises en ny fil, når makroen afspilles i overensstemmelse med trin 6.6, kaldet 2_active_zone_stack_image_name. I dette billede stables de aktive zoner, der registreres af funktionen "Find maxima", med hvide prikker i hvert plan.
   2. Åbn denne fil ved at trække og slippe den på værktøjslinjen, og vælg Billede | Stak | Z-projekt | Projektionstype = Sumudsnit. Der vil blive opnået en fremskrivning af 2_active_zone_stack_image_name.
   3. Vælg | Juster | Tærskel. Der åbnes et nyt vindue "Tærskel". Skub den øverste bjælke for at vælge en tærskelværdi, hvor alle ønskede foci/Brp-positive pletter visualiseres med rødt.
      BEMÆRK: Hvis tærsklen er sat for lavt, tælles et overskud af aktive zoner. Hvis den er sat for højt, vil en brøkdel af de aktive zoner blive savnet.
      1. Se figur 2E for eksempel. Når tærsklen er sat til 400, medtages de fleste aktive zoner (symboliseret som en 1 pixel foci) ikke i segmenteringen, da de ikke er fremhævet med rødt (Figur 2E). Når tærsklen er sat til en værdi på 50, fremhæves alle aktive zoner med rødt (figur 2E«).
   4. Definer denne værdi som minimumtærskel. Lad "Øvre punktum tærskel" på den maksimale værdi.
   5. Kør undermakroen "Analyser" for de repræsentative billeder igen med de indstillinger, der er defineret i alle de foregående trin i dette afsnit. Vurder de resulterende billedfiler kritisk, og sørg for, at segmenteringen udføres korrekt. Hvis dette ikke er tilfældet, skal indstillingerne justeres i overensstemmelse med segmenteringsfejlenes art (figur 1, tabel 1).

Representative Results

Figur 1: Eksempler på upassende resultater af makrosegmentering. Resultat billeder efter at have kørt"Drosophila NMJ Morphometrics" eller"Drosophila NMJ Bouton Morphometrics". Dele af synaptisk terminal er ikke inkluderet i den gule kontur (A). Dele af baggrunden er inkluderet i den synaptiske terminal af den gule kontur (B). Blå skeletlinje strækker sig ud over synaptisk terminal (C - D). Der registreres for mange aktive zoner (E - E'). Nogle aktive zoner forbliver uopdagede af analysen (G - G'). Aktive zoner registreres uden for synapsen (F). Forkert bouton segmentering (Kun gældende, når du kører Drosophila NMJ Bouton Morphometrics), boutons er savnet (H) eller for mange boutons opdages ved segmentering (I). Partikler som en sådan krystaller eller støv, der er en del af baggrunden er inkluderet i segmentering (J). Oplysninger om, hvordan du ændrer indstillingerne for at undgå disse fejl, findes i tabel 1. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Eksempler på justeringer af makroindstilling og deres konsekvenser for billedsegmentering. (A) Subtraher baggrundseksempel på en Dlg-1 immunolabeleret synapse, afbildet på et fluorescensmikroskop med ApoTome, når "Rullekugleradius" er indstillet til 20 (A) eller 500 (A'). (B) Outputbilleder, der er hentet efter at have kørt | Juster | Automatisk tærskel | Prøv alle billedet illustrerer billedsegmenteringer opnået ved de 16 forskellige auto-tærskel algoritmer. c) "Find Maxima" forpremiere ved opstilling af »støjtolerance« ved 50( C) og 500 ( C«) Aktive zoner, der registreres af segmenteringen, er mærket med et lille kryds. (D) Måling af de "små partikler", der optræder i billedets baggrund af en synapse immunolabeled med anti-Hrp, afbildet på et konfokalt mikroskop. (E) Fremskrivning af sumskiver" fra 2_active_zone_stack_ima-ge_name. Tærsklen er fastsat til 400 (E) og til 50 (E«). Klik her for at se en større version af dette tal.

Segmentering	Observerede fejl	Eksempel	Nødvendige justeringer
NMJ Område og omkreds (Repræsenteret af gul kontur i resultatbillede)	Dele af synaptisk terminal er enten ikke inkluderet i den gule kontur eller dele af baggrunden er inkluderet i den synaptiske terminal, der er skitseret med gult.	Figur 2A-B	Juster værdien for 'Rullekugleradius'. Se afsnit 6.1.	Juster 'NMJ outline threshold'. Se afsnit 6.2.
NMJ-længderelaterede parametre (Repræsenteret af blå skelet linje i resultaterne billedet)	Blå skelet linje enten strækker sig ud over eller er ikke til stede langs hele synaptisk terminal.	Figur 2C-D	Juster værdien for 'Rullekugleradius'. Se afsnit 6.1.	Juster 'NMJ outline threshold'. Se afsnit 6.2.
Brp-positiv punktncta (Repræsenteret af prikker i resultatbillede)	Der registreres for mange aktive zoner.	Figur 2E-E'	Reducer værdien 'Find maxima støjtolerance'. Se afsnit 6.5.
Brp-positiv punktncta (Repræsenteret af prikker i resultatbillede)	Aktive zoner gå glip af analysen.	Figur 2G-G'	Forøg værdien 'Find maxima støjtolerance'. Se afsnit 6.5.	Reducer 'Brp-puncta lavere tærskel'. Se afsnit 6.6.
Brp-positiv punktncta (Repræsenteret af prikker i resultatbillede)	Der registreres aktive zoneartefakter uden for synaptisk terminal.	Figur 2F	Juster 'Aktiv zonetærskel' punkt 6.2.	Forøg 'Brp-punktncta lavere tærskel'. Se afsnit 6.6.
Små partikler	Partikler som en sådan krystaller eller støv, der er en del af baggrunden synes at indgå i segmentering.	Figur 2J	Marker boksen 'Fjern små partikler'. Se afsnit 6.3.	Bestem små partikler maksimal størrelse. Se afsnit 6.3.
Segmentering af Bouton	Forkert segmentering af bouton (Gælder kun for Drosophila NMJ Bouton Morphometrics; Brug ikke Drosophila NMJ Morphometrics til boutonsegmentering).	Figur 2H-I	Juster 'NMJ outline threshold'. Se afsnit 6.1.	Bestem 'minimum bouton størrelse'. Se afsnit 6.4.

Tabel 1: Fejlfindingsvejledning til de forskellige typer fejl i billedsegmentering, der kan produceres af makroerne. I denne tabel beskrives forskellige typer billedsegmenteringsfejl, der er produceret af makroerne. Disse kan nemt detekteres i resultatbillederne. Eksempler på hver fejltype vises i figur 1. I afsnittet "justeringer" i tabellen fremhæves de indstillinger, der skal justeres, og brugeren henvises til det kritiske undertrin i afsnit 6, der beskriver, hvordan du justerer disse indstillinger.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining			Dilution
Mouse anti-discs large 1	Developmental Studies Hybridoma Bank	AFFN-DLG1-4D6	1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Rabbit anti-horseradish peroxidase	Jackson IR	323-005-021	1/500
Rabbit anti-Synaptotagmin	Gift from Hugo Bellen		Jan-00
Mouse anti-Cysteine string protein	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCSP-1(ab49)	1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Mouse anti-Bruchpilot	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Jan-50
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Life technologies	A11029	1/200
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568	Life technologies	A11011	1/500
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit	ThermoFisher	Z25006
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36930
Equipment
Confocal microscope or fluorescence microscope	Leica SP5
Zeiss Axio imager
Computer	Mac or Pc
Software
FIJI