Summary
Este estudo estabeleceu um protocolo com foco no refinamento técnico de um modelo murino de isquemia-reperfusão renal bilateral para pesquisa de lesão renal aguda.
Abstract
A parada cardíaca representa um grande fardo para a saúde pública. A lesão renal aguda (LRA) é um marcador adverso em sobreviventes de parada cardíaca após o retorno da circulação espontânea (RCE) após ressuscitação cardiopulmonar bem-sucedida. Por outro lado, a recuperação da função renal da LRA é um preditor de desfechos neurológicos favoráveis e alta hospitalar. No entanto, falta uma intervenção efetiva para prevenir o dano renal causado pela parada cardíaca após RCE, sugerindo que estratégias terapêuticas adicionais são necessárias. A hipoperfusão e a reperfusão renal são dois mecanismos fisiopatológicos que causam LRA após parada cardíaca. Modelos animais de IRA induzida por isquemia-reperfusão (IR-IR) de ambos os rins são comparáveis aos pacientes com LRA após RCE em um cenário clínico. No entanto, a IR-LRA de ambos os rins é tecnicamente difícil de analisar, pois o modelo está associado a alta mortalidade e ampla variação na lesão renal, o que pode afetar a análise. Foram escolhidos camundongos leves, colocados sob anestesia geral com isoflurano, submetidos à cirurgia por via dorsolateral e com temperatura corporal mantida durante a operação, reduzindo o dano tecidual e estabelecendo um protocolo reprodutível de pesquisa de IR-LRA renal aguda.
Introduction
A parada cardíaca ocorre mais de 80.000 vezes ao ano nos Estados Unidos 1,2. A taxa de mortalidade da parada cardíaca é extremamente alta 3,4,5,6. A LRA é um importante fator de risco associado à alta mortalidade e piores desfechos neurológicos em pacientes com parada cardíaca após RCE 7,8,9,10,11,12,13. A recuperação da LRA é um bom preditor de evolução neurológica favorável e alta hospitalar14,15,16. No entanto, ainda faltam terapias efetivas para IR-LRA 15,16,17,18,19. Estratégias terapêuticas adicionais são necessárias para melhorar ainda mais os desfechos clínicos da doença.
IR-IR com abordagem de isquemia renal bilateral é um dos modelos animais utilizados para pesquisa de LRA 20,21,22,23,24,25,26. Modelos animais de IR-IR renal são menos complicados do que um modelo de lesão de IR de corpo inteiro para o estudo de LRA em pacientes com parada cardíaca súbita após RCE6,27,28,29,30. Isso implica que resultados consistentes de um modelo animal de IR-IR renal são mais fáceis de alcançar devido à presença de menos fatores de confusão nos experimentos. Além disso, os protocolos renais de IR-LRA comumente envolvem uma oclusão unilateral ou bilateral do pedículo renal. Condições em experimentos com IR-IR renal bilateral são comparáveis às condições clínicas para IR após RCE em pacientes com parada cardíaca súbita após ressuscitação cardiopulmonar bem-sucedida. Embora as características patológicas dos rins em ambos os modelos reflitam as características patológicas da lesão renal humana de IR 31,32,33, uma abordagem de isquemia renal bilateral é mais relevante para LRA em condições patológicas humanas, como insuficiência cardíaca, vasoconstrição e choque séptico 35. Modelos animais bilaterais de IR-IR renal são adequados para estudos enfocando lesões renais de IR em parada cardíaca após RCE.
Modelos renais bilaterais de IR-LRA estão associados a dificuldades técnicas, complexidade experimental e longa duração da cirurgia 23,26,32,33,35,36. Para superar essas dificuldades técnicas, o presente estudo estabeleceu um protocolo de pesquisa bilateral confiável de IR-LRA em camundongos, fazendo algumas modificações técnicas. O protocolo proposto resultou em menos complicações cirúrgicas, menor dano tecidual e menor probabilidade de mortalidade durante a cirurgia. Portanto, pode ser utilizado para investigar os processos fisiopatológicos da LRA após RCE para desenvolver novas estratégias terapêuticas contra o dano de hipoperfusão e reperfusão renal37,38,39.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, publicado pelo National Institutes of Health dos EUA (publicação NIH no. 85-23, revisada em 1996). O protocolo do estudo foi aprovado e de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Católica de Fu-Jen. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais e instrumentos usados neste protocolo.
1. Preparação dos ratos
- Selecionar camundongos machos C57BL/6 de 8 semanas de idade com peso de 21-23 g.
- Abrigar e manter os ratos sob um ciclo claro e escuro de 12 h a uma temperatura controlada (21 ± 2 °C) com livre acesso a alimentos, pellets padrão de ração para camundongos e água da torneira.
2. Anestesia
- Coloque uma máscara cirúrgica e luvas estéreis.
- Colocar os camundongos sob anestesia com isoflurano a 2% misturado com oxigênio a 1 L/min na câmara de indução.
- Avaliar o nível de anestesia pelo reflexo pedalar.
NOTA: O reflexo do pedal é uma retração da pata traseira em resposta a uma pinça firme do dedo do pé. A anestesia é completa quando o reflexo pedal desaparece. - Mover e colocar cada camundongo em decúbito ventral em uma plataforma cirúrgica com uma manta elétrica para manter sua temperatura corporal assim que a anestesia estiver completa. Estabilizar a temperatura corporal antes da cirurgia e monitorar com sondas de temperatura retal. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento.
- Tape as patas dos ratos na prancha.
- Anexar uma máscara ao rosto dos ratos para fornecer um fornecimento constante de isoflurano a 1% e 1 L/min de oxigénio
- Avaliar o nível de anestesia pelo reflexo pedioso regularmente e ajustar a administração anestésica de acordo durante a cirurgia.
3. Cirurgia renal bilateral de IR-LRA
- Toque as costas e encontre a coluna lombar dos ratos manualmente. Mova-se ao longo da coluna cefálica e procure ângulos costovertebrais que estão abaixo de ambos os lados da última costela dos camundongos.
- Aplique loção depilatória em ambos os lados da região do ângulo costovertebral por aproximadamente 30 s e, em seguida, remova o pelo com soro fisiológico.
- Desinfete a pele raspada com três rodadas de solução de betadina e álcool a 75% usando bolas de algodão.
OBS: Manter um campo estéril para a cirurgia durante todo o procedimento é fundamental. Aplique um pano cirúrgico e use instrumentos estéreis. - Use pinça de ponta fina para levantar suavemente a pele abaixo do ângulo costovertebral esquerdo e, em seguida, use tesoura para criar uma incisão dorsolateral oblíqua de 1 cm ao longo das linhas de tensão da pele a partir da linha média lombar no flanco esquerdo. Transeccionar a parede muscular do flanco esquerdo com tesoura para visualizar o rim esquerdo.
- Repetir os procedimentos cirúrgicos citados acima para visualizar o rim direito. Remova as pequenas quantidades de sangue produzidas durante o procedimento com cotonetes estéreis.
- Empurre e separe o rim esquerdo cuidadosamente do tecido circundante com pinças. Identificar o pedículo renal após a exposição do rim esquerdo.
NOTA: Tenha cuidado para não ferir a glândula adrenal e os vasos sanguíneos circundantes. - Fixação sobre o pedículo renal esquerdo com clipe microvascular por 25 min. Confirme a isquemia por uma mudança visível na cor do rim de rosa para vermelho escuro.
- Cubra o rim pinçado com bolas de algodão úmidas de soro fisiológico estéril para evitar a dessecação durante o clampeamento do pedículo renal esquerdo.
- Repetir os procedimentos cirúrgicos acima mencionados para pinçar o pedículo renal direito com um clipe microvascular por 25 min.
- Cubra o rim pinçado com bolas de algodão úmidas de soro fisiológico estéril para evitar a dessecação durante o clampeamento do pedículo renal direito.
- Monitorar periodicamente a profundidade e a umidade da anestesia das bolas de algodão úmidas com soro fisiológico estéril.
- Abra o clipe microvascular esquerdo para iniciar a reperfusão do rim esquerdo. Confirme a reperfusão por uma mudança de cor visível do rim esquerdo de vermelho escuro para rosa.
- Abra o clipe microvascular direito para iniciar a reperfusão do rim direito.
- Depois que a mudança de cor do rim for verificada, devolva o rim para a cavidade abdominal.
- Fechar a cavidade abdominal e a pele com sutura absorvível 6-0.
- Esfregue para desinfetar a ferida com uma solução de betadina e álcool a 75% usando bolas de algodão.
- Observe o animal cuidadosamente até que ele comece a se mover livremente e se alimentar.
NOTA: Preste muita atenção aos animais até que eles tenham recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. - Administrar carprofeno (5 mg/kg em 0,2 mL, administrado por via subcutânea) por 2-3 dias para prevenir dor pós-cirúrgica.
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Representative Results
A qualidade da cirurgia renal bilateral de IR-IR deve ser avaliada antes de análises microscópicas ou moleculares adicionais. Durante a cirurgia, a isquemia renal deve ser confirmada verificando-se se o rim mudou de cor de rosa para vermelho escuro logo após o pedículo renal ser pinçado com um clipe microvascular (Figura 1). Após a cirurgia, o dano renal causado pela cirurgia de IR-LRA pode ser validado com alguns microlitros de soro através da coleta de sangue submandibular para análise bioquímica, onde os resultados indicam um aumento no nível de nitrogênio ureico e creatinina no sangue em relação ao valor basal (Figura 2).
Figura 1: Isquemia renal após pinçamento do pedículo renal. Uma mudança de cor do rim de rosa para vermelho escuro revelando que a perfusão renal tornou-se inadequada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Insuficiência renal após cirurgia bilateral de IR-IR. Os níveis séricos de nitrogênio ureico e creatinina no sangue aumentaram 2 dias após a reperfusão renal. Abreviações: IR-LRA = lesão renal aguda induzida por isquemia-reperfusão; ureia = nitrogênio ureico no sangue; I/R = isquemia-reperfusão (n = 4, *p < 0,05 versus controle). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo bilateral de IR-LRA proposto é adequado para investigar o mecanismo de lesão de hipoperfusão e reperfusão de ambos os rins. O protocolo sugere que camundongos leves, anestesia geral com isoflurano, abordagem dorsolateral da cirurgia e manutenção da temperatura corporal durante a operação atenuam as dificuldades técnicas associadas, encurtam a duração da cirurgia e aumentam a consistência do procedimento para pesquisa de IR-IR renal bilateral aguda.
Dificuldades técnicas influenciam a gravidade do dano renal em cirurgias renais bilaterais de IR-IR33. Além da cepa de camundongo, sexo, idade e sistemas de aquecimento 36,40,41,42,43,44, o posicionamento adequado da pinça vascular é essencial para resultados consistentes. Estudos têm recomendado dissecção cuidadosa do tecido adiposo circundante para liberar os pedículos ou artérias renais e renais 23,26,32,35,36. Em comparação com camundongos de 8-20 semanas de idade tipicamente pesando 25-28 g que têm sido estudados na literatura 23,32,35,36, este estudo usou camundongos relativamente jovens e leves (8 semanas de idade e pesando 21-23 g) para reduzir a quantidade de tecido adiposo perirrenal, o que poderia expor os pedículos renal e renal facilmente sem a necessidade de dissecção do tecido periférico e colocação adequada das pinças vasculares. Isso reduziria o trauma relacionado ao procedimento e a complexidade técnica, encurtaria a duração da anestesia e da cirurgia, aceleraria a curva de aprendizado para aqueles que não estão familiarizados com o procedimento do estudo e aumentaria a reprodutibilidade do estudo.
A anestesia geral influencia os resultados de um estudo de IR-LRA. A anestesia prolongada aumenta a perda de animais durante a cirurgia33. Na literatura, o fenobarbital sódico, um barbitúrico de longa duração que deprime o sistema nervoso central, tem sido administrado por via subcutânea para cirurgia de IR-LRA 26,33,35. O fenobarbital instala-se após 5 min e ajuda a obter anestesia cirúrgica em pelo menos 15 min45. Portanto, o fenobarbital deve ser administrado apenas por cirurgiões experientes para evitar prolongamento da anestesia (>60 mg/kg) e perda de animais durante a cirurgia33. Por outro lado, o uso do isoflurano, que é um anestésico inalatório não inflamável, deste estudo induziu um início rápido que atingiu a anestesia cirúrgica em 7-10 min e cessou o efeito em 15 min após a interrupção da inalação46. A administração de isoflurano, em conjunto com oxigênio, é fácil para o operador iniciar, manter e parar instantaneamente durante a cirurgia e é sugerida para cirurgia de IR-LRA renal.
Finalmente, o método de abordagem dos pedículos renais pode influenciar a qualidade da cirurgia de IR-IR. Alguns estudos de IR-LRA investigaram o pedículo renal usando laparotomia mediana, onde a cavidade abdominal foi aberta, e o peritônio e os intestinos foram afastados para acessar o rim. No entanto, isso pode aumentar a perda de líquidos e calor, o trauma relacionado à cirurgia e a duração da cirurgia32,35. Portanto, este protocolo sugere uma abordagem dorsolateral para a pesquisa de IR-LRA para expor o rim do flanco e do retroperitônio para manter a temperatura corporal e minimizar a lesão relacionada à cirurgia, melhorando posteriormente a condição cirúrgica e a consistência do estudo.
Esse modelo tem potencial aplicação em estudos que visem identificar e caracterizar marcadores de lesão renal bilateral causados por parada cardíaca após RCE. No entanto, a liberação de citocinas devido ao dano cirúrgico durante o procedimento pode influenciar os resultados do estudo, tornando-os não relacionáveis com o cenário clínico e limitando a tradução dos resultados do estudo da beira da bancada para a beira do leito.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse relacionados à publicação deste artigo.
Acknowledgments
Este modelo foi desenvolvido com o apoio financeiro do Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan (MOST 109-2320-B-030-006-MY3). Este manuscrito foi editado pela Wallace Academic Editing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbable Suture, 6-0 | Ethicon | J510G-BX | |
| Betadine solution | Shineteh Istrument | ||
| Carprofen | Sigma | PHR1452 | |
| Cotton balls | Shineteh Istrument | ||
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Heating pad | Shineteh Istrument | ||
| Isoflurane | Piramal Critical Care Inc. | 26675-46-7 | |
| Moria Vessel Clamp | Fine Science Tools | 18320-11 | |
| Olsen-Hegar needle holder | Fine Science Tools | 12002 - 12 | |
| Saline | Shineteh Istrument | ||
| Scalpel blades | Shinva | s2646 | |
| Small Animal Anesthesia Machine | Sheng-Cing Instruments Co. | STEP AS-01 | |
| Tissue scissors | Fine Science Tools | 14072 - 10 |
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