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급성 신장 손상 연구를 위한 양측 신장 허혈-재관류 마우스 모델의 기술적 개선

Published: November 3, 2023 doi: 10.3791/63957
Automatic Translation
1, 1, 2,3
1Department of Life Science, Fu Jen Catholic University, 2MacKay Junior College of Medicine, Nursing, and Management, 3Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Department of Internal Medicine, MacKay Memorial Hospital

Summary

이 연구는 급성 신장 손상 연구를 위한 양측 신장 허혈 재관류의 마우스 모델의 기술적 개선에 중점을 둔 프로토콜을 수립했습니다.

Abstract

심정지는 공중 보건에 큰 부담을 줍니다. 급성 신장 손상(AKI)은 성공적인 심폐 소생술 후 자연 순환 복귀(ROSC)에 따른 심정지 생존자의 부작용 지표입니다. 반대로, AKI에서 신장 기능의 회복은 양호한 신경학적 결과와 퇴원을 예측하는 변수입니다. 그러나 ROSC 후 심정지로 인한 신장 손상을 예방하기 위한 효과적인 중재가 부족하여 추가적인 치료 전략이 필요한 것으로 나타났다. 신장 저관류와 재관류는 심정지 후 AKI를 유발하는 두 가지 병태생리학적 기전입니다. 양쪽 신장의 허혈-재관류 유도 AKI(IR-AKI) 동물 모델은 임상 환경에서 ROSC 후 AKI 환자와 유사합니다. 그러나 두 신장의 IR-AKI는 모델이 높은 사망률과 신장 손상의 광범위한 변동과 관련이 있어 분석에 영향을 미칠 수 있기 때문에 기술적으로 분석하기 어렵습니다. 경량 마우스를 선택하여 이소플루란으로 전신 마취를 하고 배측 접근법으로 수술을 하고 수술 중 체온을 유지하여 조직 손상을 줄이고 재현 가능한 급성 신장 IR-AKI 연구 프로토콜을 확립했습니다.

Introduction

미국에서는 매년 80,000회 이상 심정지가 발생합니다 1,2. 심정지의 사망률은 매우 높습니다 3,4,5,6. AKI는 ROSC 7,8,9,10,11,12,13 후 심정지 환자의 높은 사망률 및 열악한 신경학적 결과와 관련된 주요 위험 인자입니다. AKI로부터의 회복은 양호한 신경학적 결과와 퇴원에 대한 좋은 예측 변수이다14,15,16. 그러나 IR-AKI에 대한 효과적인 치료법은 여전히부족하다 15,16,17,18,19. 질병의 임상 결과를 더욱 개선하기 위해서는 추가적인 치료 전략이 필요합니다.

양측 신장 허혈 접근법을 가진 IR-AKI는 AKI 연구에 사용되는 동물 모델 중 하나입니다 20,21,22,23,24,25,26. 신장 IR-AKI 동물 모델은 ROSC 6,27,28,29,30에 따른 급성 심정지 환자의 AKI 연구를 위한 전신 IR 손상 모델보다 덜 복잡합니다. 이는 신장 IR-AKI 동물 모델의 일관된 결과가 실험에서 교란 요인이 적기 때문에 더 쉽게 얻을 수 있음을 의미합니다. 또한, 신장 IR-AKI 프로토콜은 일반적으로 편측 또는 양측 신장 척추경 폐색을 포함합니다. 양측 신장 IR-AKI에 대한 실험의 조건은 성공적인 심폐 소생술 후 급성 심정지 환자에서 ROSC 후 AKI의 임상 상태와 유사합니다. 두 모델 모두에서 신장의 병리학적 특성은 인간 신장 IR 손상의 병리학적 특성을 반영하지만(31,32,33), 양측 신장 허혈 접근법은 심부전, 혈관 수축 및 패혈성 쇼크와 같은 인간 병리학적 조건에서 AKI와 더 관련이 있다 35. 양측 신장 IR-AKI 동물 모델은 ROSC 후 심정지 시 신장 IR 손상에 초점을 맞춘 연구에 적합합니다.

양측 신장 IR-AKI 모델은 기술적 어려움, 실험 복잡성 및 긴 수술 기간과 관련이 있다 23,26,32,33,35,36. 이러한 기술적 어려움을 극복하기 위해 본 연구는 몇 가지 기술적 수정을 통해 마우스에서 신뢰할 수 있는 양자 IR-AKI 연구 프로토콜을 확립했습니다. 제안된 프로토콜은 수술 합병증을 줄이고 조직 손상을 줄이며 수술 중 사망 가능성을 낮췄습니다. 따라서 ROSC 후 AKI의 병태생리학적 과정을 조사하여 신장 저관류 및 재관류 손상에 대한 새로운 치료 전략을 개발하는 데 사용할 수 있습니다37,38,39.

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Protocol

모든 동물 실험은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)에서 발행한 실험동물 관리 및 사용 가이드(NIH publication no. 85-23, 1996년 개정)에 따라 수행되었습니다. 연구 프로토콜은 Fu-Jen Catholic University의 Institutional Animal Care and Use Committee의 지침에 따라 승인되었습니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료 및 도구에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 마우스 준비

  1. 체중이 21-23g인 8주 된 C57BL/6 수컷 마우스를 선택합니다.
  2. 음식, 표준 쥐 사료 알갱이 및 수돗물에 자유롭게 접근할 수 있는 제어된 온도(21 ± 2°C)에서 12시간 동안 밝고 어두운 주기로 쥐를 수용하고 유지합니다.

2. 마취

  1. 수술용 마스크와 멸균 장갑을 착용하십시오.
  2. 유도 챔버에서 1L/min의 속도로 산소와 혼합된 2% 이소플루란으로 마우스를 마취시킵니다.
  3. 페달 반사로 마취 수준을 평가합니다.
    알림: 페달 반사는 단단한 발가락 꼬집기에 대한 반응으로 뒷발을 후퇴시키는 것입니다. 페달 반사가 사라지면 마취가 완료됩니다.
  4. 마취가 완료된 후 체온을 유지하기 위해 전기 담요가 있는 수술 플랫폼에서 각 마우스를 엎드린 자세로 이동하고 놓습니다. 수술 전에 체온을 안정시키고 직장 온도 프로브로 모니터링합니다. 건조함을 방지하기 위해 양쪽 눈에 안과 연고를 바르십시오.
  5. 쥐의 발을 보드에 테이프로 붙입니다.
  6. 생쥐의 얼굴에 마스크를 부착하여 1% 이소플루란과 1L/min 산소를 지속적으로 공급합니다.
  7. 정기적으로 페달 반사로 마취 수준을 평가하고 수술 중에 그에 따라 마취 전달을 조정합니다.

3. 양측 신장 IR-AKI 수술

  1. 등을 터치하고 수동으로 쥐의 요추를 찾으십시오. 척추를 따라 두부로 이동하고 쥐의 마지막 갈비뼈 양쪽 아래에 있는 늑골 두각을 찾습니다.
  2. 약 30초 동안 늑골 부위 양쪽에 제모 로션을 바른 후 식염수로 털을 제거합니다.
  3. 면도한 피부를 면봉을 사용하여 베타딘 용액과 75% 알코올로 3회 소독합니다.
    알림: 시술 전반에 걸쳐 수술을 위한 멸균 필드를 유지하는 것이 중요합니다. 수술용 드레이프를 적용하고 멸균 기구를 사용하십시오.
  4. 끝이 가는 집게를 사용하여 왼쪽 늑골 치골 각도 아래로 피부를 부드럽게 들어 올린 다음 가위를 사용하여 왼쪽 옆구리의 요추 정중선에서 피부 장력 라인을 따라 1cm의 비스듬한 배외측 절개를 만듭니다. 왼쪽 신장을 시각화하기 위해 가위를 사용하여 왼쪽 옆구리의 근육 벽을 가로지릅니다.
  5. 앞서 언급한 수술 절차를 반복하여 오른쪽 신장을 시각화합니다. 시술 중 발생하는 소량의 혈액을 멸균 면봉으로 제거합니다.
  6. 왼쪽 신장을 집게로 조심스럽게 밀어서 주변 조직에서 분리합니다. 왼쪽 신장이 노출된 후 신장 척추경을 확인합니다.
    알림: 부신과 주변 혈관을 다치지 않도록 주의하십시오.
  7. Clamp 미세혈관 클립으로 왼쪽 신장 척추경을 25분 동안 고정합니다. 분홍색에서 짙은 빨간색으로 신장 색상의 눈에 띄는 변화로 허혈을 확인합니다.
  8. 왼쪽 신장 척추경 클램핑 중 건조를 방지하기 위해 멸균 식염수 젖은 면봉으로 고정된 신장을 덮습니다.
  9. 앞서 언급한 수술 절차를 반복하여 미세혈관 클립으로 오른쪽 신장 척추경을 25분 동안 고정합니다.
  10. 오른쪽 신장 척추경 클램핑 중 건조를 방지하기 위해 멸균 식염수 젖은 면봉으로 고정된 신장을 덮습니다.
  11. 멸균 식염수 젖은 면봉의 마취 깊이와 습도를 주기적으로 모니터링하십시오.
  12. 왼쪽 미세혈관 클립을 열어 왼쪽 신장의 재관류를 시작합니다. 왼쪽 신장이 짙은 빨간색에서 분홍색으로 눈에 띄는 색 변화로 재관류를 확인합니다.
  13. 오른쪽 미세혈관 클립을 열어 오른쪽 신장의 재관류를 시작합니다.
  14. 신장 색 변화가 확인되면 신장을 복강으로 되돌립니다.
  15. 복강과 피부를 6-0 흡수성 봉합사로 봉합합니다.
  16. 면봉을 사용하여 베타딘 용액과 75% 알코올로 상처를 소독하기 위해 문지릅니다.
  17. 동물이 자유롭게 움직이고 먹이를 먹기 시작할 때까지 주의 깊게 관찰하십시오.
    알림: 동물이 흉골 누운 상태를 유지하기에 충분한 의식을 회복할 때까지 세심한 주의를 기울이십시오.
  18. 수술 후 통증을 예방하기 위해 카프로펜(0.2mL 중 5mg/kg, 피하 투여)을 2-3일 동안 투여합니다.

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Representative Results

양측 신장 IR-AKI 수술의 질은 추가 현미경 또는 분자 분석 전에 평가되어야 합니다. 수술 중 신장 허혈은 신장 척추경을 미세혈관 클립으로 고정한 직후 신장의 색이 분홍색에서 짙은 빨간색으로 변했는지 여부를 확인하여 확인해야 합니다(그림 1). 수술 후 IR-AKI 수술로 인한 신장 손상은 생화학적 분석을 위한 턱밑 혈액 채취를 통해 몇 마이크로리터의 혈청으로 추가로 검증할 수 있으며, 그 결과 기준선에서 혈중 요소, 질소 및 크레아티닌 수치가 증가한 것으로 나타났습니다(그림 2).

Figure 1
그림 1: 신장 척추경 클램핑 후 신장 허혈. 신장 색이 분홍색에서 짙은 빨간색으로 변하는 것은 신장 관류가 부적절해졌음을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 양측 IR-AKI 수술 후 신부전. 혈중 요소, 질소 및 크레아티닌의 혈청 수치는 신장 재관류 2일 후에 증가했습니다. 약어: IR-AKI = 허혈-재관류 유발 급성 신장 손상; BUN = 혈액 요소 질소; I/R = 허혈-재관류(n = 4, *p < 대조군 대비 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

제안된 양측 IR-AKI 프로토콜은 양쪽 신장의 저관류 및 재관류 손상 메커니즘을 조사하는 데 적합합니다. 이 프로토콜은 가벼운 마우스, 이소플루란을 사용한 전신 마취, 수술에 대한 배측 접근 및 수술 중 체온 유지가 관련 기술적 어려움을 완화하고 수술 기간을 단축하며 급성 양측 신장 IR-AKI 연구를 위한 절차의 일관성을 높일 것을 제안합니다.

양측 신장 IR-AKI 수술에서 신장 손상 중증도에 영향을 미치는 기술적 어려움33. 마우스 변형, 성별, 연령 및 가열 시스템(36,40,41,42,43,44) 외에도 혈관 클램프의 적절한 배치는 일관된 결과를 위해 필수적입니다. 연구에 따르면 신장 및 신장 척추경 또는 동맥을 풀어주기 위해 주변 지방 조직을 조심스럽게 절개할 것을 권장하고 있습니다 23,26,32,35,36. 문헌 23,32,35,36에서 연구된 일반적으로 체중이 25-28g인 8-20주 된 마우스와 비교하여, 이 연구는 비교적 젊고 가벼운 마우스(생후 8주령, 체중 21-23g)를 사용하여 신장 주위 지방 조직의 양을 줄였으며, 이는 말초 조직 절개 및 혈관 클램프의 적절한 배치 없이 신장 및 신장 척추경을 쉽게 노출시킬 수 있었습니다. 이를 통해 절차 관련 외상과 기술적 복잡성을 줄이고, 마취 및 수술 기간을 단축하고, 연구 절차에 익숙하지 않은 사람들의 학습 곡선을 빠르게 하고, 연구의 재현성을 높일 수 있습니다.

전신 마취는 IR-AKI 연구 결과에 영향을 미칩니다. 마취가 길어지면 수술 중 동물 손실이 증가한다33. 문헌에서, 중추 신경계를 억제하는 지속성 바르비투르산염인 페노바르비탈 나트륨이 IR-AKI 수술을 위해 피하 투여되었다 26,33,35. 페노바르비탈은 5분 후에 시작되며 최소 15분45분 내에 외과적 마취를 달성하는 데 도움이 됩니다. 따라서 페노바르비탈은 수술 중 마취 연장(>60mg/kg)과 동물 손실을 피하기 위해 숙련된 외과의사에 의해서만 전달되어야 한다33. 이에 반해 본 연구에서는 불연성 흡입 마취제인 이소플루란을 사용하여 7-10분 내에 외과적 마취를 달성하고 흡입 중지 후 15분 만에 효과가 중단되는 빠른 발병을 유도하였다46. 산소와 함께 이소플루란을 투여하면 시술자가 수술 중 즉시 시작, 유지 및 중지할 수 있으며 신장 IR-AKI 수술에 권장됩니다.

마지막으로, 신장 척추경에 접근하는 방법은 IR-AKI 수술의 질에 영향을 미칠 수 있습니다. 일부 IR-AKI 연구에서는 복강을 열고 복막과 장을 옆으로 밀어 신장에 접근하는 정중선 개복술을 사용하여 신장 척추경을 조사했습니다. 그러나, 그렇게 하는 것은 체액 및 열 손실, 수술 관련 외상, 수술 기간을 증가시킬 수 있다32,35. 따라서 이 프로토콜은 IR-AKI 연구에서 옆구리와 후복막에서 신장을 노출시켜 체온을 유지하고 수술 관련 부상을 최소화하여 수술 상태와 연구 일관성을 개선하는 배측 접근법을 제안합니다.

이 모델은 ROSC 후 심정지로 인한 양측 신장 손상의 마커를 식별하고 특성화하는 것을 목표로 하는 연구에 잠재적으로 적용할 수 있습니다. 그러나 시술 중 외과적 손상으로 인해 방출되는 사이토카인은 연구 결과에 영향을 미쳐 임상 시나리오와 관련이 없고 연구 결과를 벤치사이드에서 베드사이드로 변환하는 것을 제한할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 이 기사의 출판과 관련하여 이해 상충이 없음을 선언합니다.

Acknowledgments

이 모델은 대만 과학기술부(MOST 109-2320-B-030-006-MY3)의 재정 지원으로 개발되었습니다. 이 원고는 Wallace Academic Editing에서 편집했습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbable Suture, 6-0 Ethicon J510G-BX
Betadine solution Shineteh Istrument
Carprofen Sigma PHR1452
Cotton balls Shineteh Istrument
Graefe Forceps Fine Science Tools 11051-10
Heating pad Shineteh Istrument
Isoflurane Piramal Critical Care Inc. 26675-46-7
Moria Vessel Clamp Fine Science Tools 18320-11
Olsen-Hegar needle holder Fine Science Tools 12002 - 12
Saline Shineteh Istrument
Scalpel blades Shinva s2646
Small Animal Anesthesia Machine Sheng-Cing Instruments Co. STEP AS-01
Tissue scissors Fine Science Tools 14072 - 10

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