Summary
इस अध्ययन ने तीव्र गुर्दे की चोट अनुसंधान के लिए द्विपक्षीय गुर्दे इस्किमिया के माउस मॉडल के तकनीकी शोधन पर ध्यान केंद्रित करने वाला एक प्रोटोकॉल स्थापित किया।
Abstract
कार्डियक अरेस्ट एक बड़ा सार्वजनिक स्वास्थ्य बोझ है। तीव्र गुर्दे की चोट (एकेआई) सफल कार्डियोपल्मोनरी पुनर्जीवन के बाद सहज परिसंचरण (आरओएससी) की वापसी के बाद कार्डियक अरेस्ट से बचे लोगों में एक प्रतिकूल मार्कर है। इसके विपरीत, एकेआई से गुर्दे के कार्य की वसूली अनुकूल न्यूरोलॉजिकल परिणामों और अस्पताल के निर्वहन का एक भविष्यवक्ता है। हालांकि, आरओएससी के बाद कार्डियक अरेस्ट के कारण गुर्दे की क्षति को रोकने के लिए एक प्रभावी हस्तक्षेप की कमी है, यह सुझाव देते हुए कि अतिरिक्त चिकित्सीय रणनीतियों की आवश्यकता है। रीनल हाइपोपरफ्यूज़न और रीपरफ्यूजन दो पैथोफिजियोलॉजिकल तंत्र हैं जो कार्डियक अरेस्ट के बाद एकेआई का कारण बनते हैं। दोनों गुर्दे के इस्किमिया-रीपरफ्यूजन-प्रेरित एकेआई (आईआर-एकेआई) के पशु मॉडल नैदानिक सेटिंग में आरओएससी के बाद एकेआई वाले रोगियों के साथ तुलनीय हैं। हालांकि, दोनों गुर्दे के आईआर-एकेआई का विश्लेषण करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है क्योंकि मॉडल उच्च मृत्यु दर और गुर्दे की क्षति में व्यापक भिन्नता से जुड़ा हुआ है, जो विश्लेषण को प्रभावित कर सकता है। हल्के चूहों को चुना गया, आइसोफ्लुरेन के साथ सामान्य संज्ञाहरण के तहत रखा गया, एक डोरसोलेटरल दृष्टिकोण के साथ सर्जरी के अधीन किया गया, और ऑपरेशन के दौरान उनके शरीर का तापमान बनाए रखा गया, जिससे ऊतक क्षति कम हो गई और एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तीव्र गुर्दे आईआर-एकेआई अनुसंधान प्रोटोकॉल स्थापित हुआ।
Introduction
संयुक्तराज्य अमेरिका में कार्डियक अरेस्ट सालाना 80,000 से अधिक बार होता है। कार्डियक अरेस्ट की मृत्यु दर बहुत अधिक 3,4,5,6 है। आरओएससी 7,8,9,10,11,12,13 के बाद कार्डियक अरेस्ट वाले रोगियों में एकेआई उच्च मृत्यु दर और खराब न्यूरोलॉजिकल परिणामों से जुड़ा एक प्रमुख जोखिम कारक है। एकेआई से वसूली अनुकूल न्यूरोलॉजिकल परिणामों और अस्पताल से छुट्टी14,15,16 का एक अच्छा भविष्यवक्ता है। हालांकि, आईआर-एकेआई के लिए प्रभावी उपचारों में अभी भी15,16,17,18,19 की कमी है। रोग के नैदानिक परिणामों को और बेहतर बनाने के लिए अतिरिक्त चिकित्सीय रणनीतियों की आवश्यकता होती है।
द्विपक्षीय गुर्दे इस्किमिया दृष्टिकोण के साथ आईआर-एकेआई एकेआई अनुसंधान 20,21,22,23,24,25,26 के लिए उपयोग किए जाने वाले पशु मॉडल में से एक है। आरओएससी 6,27,28,29,30 के बाद अचानक कार्डियक अरेस्ट वाले रोगियों में एकेआई के अध्ययन के लिए रीनल आईआर-एकेआई पशु मॉडल पूरे शरीर के आईआर चोट मॉडल की तुलना में कम जटिल हैं। इसका तात्पर्य यह है कि प्रयोगों में कम भ्रामक कारकों की उपस्थिति के कारण गुर्दे के आईआर-एकेआई पशु मॉडल से लगातार परिणाम प्राप्त करना आसान है। इसके अलावा, गुर्दे के आईआर-एकेआई प्रोटोकॉल में आमतौर पर एकतरफा या द्विपक्षीय गुर्दे का पेडीकल रोड़ा शामिल होता है। द्विपक्षीय गुर्दे आईआर-एकेआई पर प्रयोगों में स्थितियां सफल कार्डियोपल्मोनरी पुनर्जीवन के बाद अचानक कार्डियक अरेस्ट वाले रोगियों में आरओएससी के बाद एकेआई के लिए नैदानिक स्थितियों के बराबर हैं। यद्यपि दोनों मॉडलों में गुर्दे की रोग संबंधी विशेषताएं मानव गुर्दे आईआर चोट 31,32,33 की रोग संबंधी विशेषताओं को दर्शाती हैं, एक द्विपक्षीय वृक्क इस्किमिया दृष्टिकोण मानव रोग स्थितियों के तहत एकेआई के लिए अधिक प्रासंगिक है, जैसे कि हृदय की विफलता, वाहिकासंकीर्णन, और सेप्टिक शॉक 35। द्विपक्षीय गुर्दे आईआर-एकेआई पशु मॉडल आरओएससी के बाद कार्डियक अरेस्ट में गुर्दे की आईआर चोटों पर ध्यान केंद्रित करने वाले अध्ययनों के लिए उपयुक्त हैं।
द्विपक्षीय गुर्दे आईआर-एकेआई मॉडल तकनीकी कठिनाइयों, प्रयोगात्मक जटिलता और लंबी सर्जरी अवधि 23,26,32,33,35,36 से जुड़े हैं। इन तकनीकी कठिनाइयों को दूर करने के लिए, वर्तमान अध्ययन ने कुछ तकनीकी संशोधन करके चूहों में एक विश्वसनीय द्विपक्षीय आईआर-एकेआई अनुसंधान प्रोटोकॉल स्थापित किया। प्रस्तावित प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप कम शल्य चिकित्सा जटिलताओं, कम ऊतक क्षति और सर्जरी के दौरान मृत्यु दर की कम संभावना थी। इसलिए, इसका उपयोग आरओएससी के बाद एकेआई की पैथोफिजियोलॉजिकल प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए किया जा सकता है ताकि गुर्दे के हाइपोपरफ्यूजन और रीपरफ्यूजन क्षति37,38,39 के खिलाफ नई चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित किया जा सके।
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Protocol
सभी पशु प्रयोग ों को यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच प्रकाशन संख्या 85-23, संशोधित 1996) द्वारा प्रकाशित प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुसार आयोजित किया गया था। अध्ययन प्रोटोकॉल को फू-जेन कैथोलिक विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार अनुमोदित किया गया था। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों और उपकरणों के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।
1. चूहों को तैयार करना
- 21-23 ग्राम वजन के साथ 8 सप्ताह के सी 57बीएल / 6 नर चूहों का चयन करें।
- भोजन, मानक माउस भोजन छर्रों और नल के पानी तक मुफ्त पहुंच के साथ नियंत्रित तापमान (21 ± 2 डिग्री सेल्सियस) पर चूहों को 12 घंटे के प्रकाश और अंधेरे चक्र के तहत घर और बनाए रखें।
2. एनेस्थीसिया
- एक सर्जिकल मास्क और बाँझ दस्ताने पहनें।
- चूहों को एनेस्थीसिया के तहत 2% आइसोफ्लुरेन के साथ इंडक्शन चैंबर में 1 एल / मिनट पर ऑक्सीजन के साथ मिश्रित करें।
- पेडल रिफ्लेक्स द्वारा संज्ञाहरण के स्तर का आकलन करें।
नोट: पेडल रिफ्लेक्स एक दृढ़ पैर की अंगुली चुटकी के जवाब में पिछले पंजे का एक पीछे हटना है। पेडल रिफ्लेक्स गायब होने पर एनेस्थेटाइजेशन पूरा हो जाता है। - एनेस्थेटाइजेशन पूरा होने के बाद अपने शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए प्रत्येक माउस को एक इलेक्ट्रिक कंबल के साथ सर्जरी प्लेटफॉर्म पर प्रवण स्थिति में स्थानांतरित करें और रखें। सर्जरी से पहले शरीर के तापमान को स्थिर करें और मलाशय के तापमान की जांच के साथ निगरानी करें। सूखापन को रोकने के लिए दोनों आंखों पर नेत्र मरहम लगाएं।
- चूहों के पंजों को बोर्ड पर टेप करें।
- 1% आइसोफ्लुरेन और 1 एल / मिनट ऑक्सीजन की निरंतर आपूर्ति प्रदान करने के लिए चूहों के चेहरे पर एक मास्क संलग्न करें।
- नियमित रूप से पेडल रिफ्लेक्स द्वारा संज्ञाहरण के स्तर का आकलन करें और सर्जरी के दौरान तदनुसार एनेस्थेटिक डिलीवरी को समायोजित करें।
3. द्विपक्षीय गुर्दे आईआर-एकेआई सर्जरी
- पीठ को स्पर्श करें और चूहों की काठ की रीढ़ को मैन्युअल रूप से ढूंढें। रीढ़ की हड्डी के साथ सेफेलरूप से आगे बढ़ें और कोस्टोवर्टेब्रल कोणों की तलाश करें जो चूहों की अंतिम पसली के दोनों किनारों के नीचे हैं।
- लगभग 30 सेकंड के लिए कोस्टोवर्टेब्रल कोण क्षेत्र के दोनों किनारों पर हेयर रिमूवल लोशन लागू करें और फिर नमकीन के साथ फर को हटा दें।
- सूती गेंदों का उपयोग करके बीटाडीन समाधान के तीन राउंड और 75% अल्कोहल के साथ मुंडा त्वचा को कीटाणुरहित करें।
नोट: प्रक्रिया के दौरान सर्जरी के लिए एक बाँझ क्षेत्र बनाए रखना महत्वपूर्ण है। एक सर्जिकल ड्रेप लागू करें और बाँझ उपकरणों का उपयोग करें। - बाएं कोस्टोवर्टेब्रल कोण के नीचे त्वचा को धीरे से उठाने के लिए फाइन-टिप फोर्स का उपयोग करें, और फिर बाएं फ्लैंक पर काठ की मध्य रेखा से त्वचा तनाव रेखाओं के साथ 1 सेमी तिरछा डोरसोलेटरल चीरा बनाने के लिए कैंची का उपयोग करें। बाएं गुर्दे की कल्पना करने के लिए कैंची का उपयोग करके बाएं फ्लैंक की मांसपेशियों की दीवार को सही करें।
- सही गुर्दे की कल्पना करने के लिए उपरोक्त शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं को दोहराएं। बाँझ कपास के स्वैब के साथ प्रक्रिया के दौरान उत्पादित रक्त की थोड़ी मात्रा को हटा दें।
- बाएं गुर्दे को बल के साथ आसपास के ऊतक से सावधानी पूर्वक धक्का दें और अलग करें। बाईं किडनी के उजागर होने के बाद रीनल पेडिकल की पहचान करें।
नोट: अधिवृक्क ग्रंथि और आसपास की रक्त वाहिकाओं को चोट न पहुंचाने के लिए सावधान रहें। - 25 मिनट के लिए माइक्रोवस्कुलर क्लिप के साथ बाएं गुर्दे के पेडिकल पर क्लैंप करें। गुलाबी से गहरे लाल रंग में गुर्दे के रंग में दिखाई देने वाले परिवर्तन से इस्किमिया की पुष्टि करें।
- बाएं गुर्दे के पेडिकल क्लैंपिंग के दौरान निर्जलीकरण से बचने के लिए बाँझ नमकीन गीली कपास की गेंदों के साथ क्लैंप किए गए गुर्दे को कवर करें।
- 25 मिनट के लिए माइक्रोवस्कुलर क्लिप के साथ दाहिने गुर्दे के पेडिकल को दबाने के लिए उपरोक्त शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं को दोहराएं।
- दाहिने गुर्दे के पेडिकल क्लैंपिंग के दौरान निर्जलीकरण से बचने के लिए बाँझ नमकीन गीली कपास की गेंदों के साथ क्लैंप किए गए गुर्दे को कवर करें।
- समय-समय पर बाँझ खारा गीली कपास गेंदों की संज्ञाहरण गहराई और आर्द्रता की निगरानी करें।
- बाएं गुर्दे के रीपरफ्यूजन को शुरू करने के लिए बाएं माइक्रोवस्कुलर क्लिप खोलें। बाएं गुर्दे के गहरे लाल से गुलाबी रंग में दिखाई देने वाले रंग परिवर्तन द्वारा पुनरावृत्ति की पुष्टि करें।
- दाहिने गुर्दे के रीपरफ्यूजन को शुरू करने के लिए सही माइक्रोवस्कुलर क्लिप खोलें।
- गुर्दे के रंग परिवर्तन को सत्यापित करने के बाद, गुर्दे को पेट की गुहा में वापस कर दें।
- 6-0 अवशोषित सीवन सामग्री के साथ पेट की गुहा और त्वचा को बंद करें।
- घाव को बीटाडीन घोल और कपास की गेंदों का उपयोग करके 75% अल्कोहल के साथ कीटाणुरहित करने के लिए स्क्रब करें।
- जानवर को ध्यान से देखें जब तक कि वह स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ना और खिलाना शुरू न कर दे।
नोट: जानवरों पर पूरा ध्यान दें जब तक कि वे उरोस्थि की पुनरावृत्ति को बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर लें। - पोस्टसर्जिकल दर्द को रोकने के लिए 2-3 दिनों के लिए कारप्रोफेन (0.2 एमएल में 5 मिलीग्राम / किग्रा, चमड़े के नीचे प्रशासित) का प्रशासन करें।
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Representative Results
आगे के सूक्ष्म या आणविक विश्लेषण से पहले द्विपक्षीय गुर्दे आईआर-एकेआई सर्जरी की गुणवत्ता का आकलन किया जाना चाहिए। सर्जरी के दौरान, गुर्दे के इस्किमिया की पुष्टि यह देखकर की जानी चाहिए कि गुर्दे के पेडिकल को माइक्रोवस्कुलर क्लिप (चित्रा 1) के साथ दबाने के तुरंत बाद गुर्दे का रंग गुलाबी से गहरे लाल रंग में बदल गया है या नहीं। सर्जरी के बाद, आईआर-एकेआई सर्जरी के कारण गुर्दे की क्षति को जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए सबमैंडिबुलर रक्त संग्रह के माध्यम से सीरम के कुछ माइक्रोलीटर के साथ आगे मान्य किया जा सकता है जहां परिणाम बेसलाइन से रक्त यूरिया नाइट्रोजन और क्रिएटिनिन के स्तर में वृद्धि का संकेत देते हैं (चित्रा 2)।
चित्रा 1: रीनल पेडिकल क्लैंपिंग के बाद रीनल इस्किमिया। एक गुर्दे का रंग गुलाबी से गहरे लाल रंग में बदल जाता है जिससे पता चलता है कि गुर्दे का छिड़काव अपर्याप्त हो गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: द्विपक्षीय आईआर-एकेआई सर्जरी के बाद गुर्दे की अपर्याप्तता। रक्त यूरिया नाइट्रोजन और क्रिएटिनिन के सीरम स्तर गुर्दे के रीपरफ्यूजन के 2 दिन बाद बढ़ गए। संक्षेप: आईआर-एकेआई = इस्किमिया-प्रेरित तीव्र गुर्दे की चोट; बीयूएन = रक्त यूरिया नाइट्रोजन; I/R = इस्किमिया-रीपरफ्यूजन (n = 4, *p < 0.05 बनाम नियंत्रण)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
प्रस्तावित द्विपक्षीय आईआर-एकेआई प्रोटोकॉल दोनों गुर्दे के हाइपोपरफ्यूजन और रीपरफ्यूजन चोट के तंत्र की जांच के लिए उपयुक्त है। प्रोटोकॉल से पता चलता है कि हल्के चूहों, आइसोफ्लुरेन के साथ सामान्य संज्ञाहरण, सर्जरी के लिए एक डोरसोलेटरल दृष्टिकोण, और ऑपरेशन के दौरान शरीर का तापमान रखरखाव संबंधित तकनीकी कठिनाइयों को कम करता है, सर्जरी की अवधि को कम करता है, और तीव्र द्विपक्षीय गुर्दे आईआर-एकेआई अनुसंधान के लिए प्रक्रिया की स्थिरता को बढ़ाता है।
तकनीकी कठिनाइयां द्विपक्षीय गुर्दे आईआर-एकेआईसर्जरी में गुर्दे की क्षति की गंभीरता को प्रभावित करती हैं। माउस तनाव, लिंग, आयु और हीटिंग सिस्टम 36,40,41,42,43,44 के अलावा, लगातार परिणामों के लिए संवहनी क्लैंप का उचित प्लेसमेंट आवश्यक है। अध्ययनों ने गुर्दे और गुर्दे के पेडिकल्स या धमनियों को छोड़ने के लिए आसपास के वसा ऊतक के सावधानीपूर्वक विच्छेदन की सिफारिश की है 23,26,32,35,36। 8-20 सप्ताह की आयु के चूहों की तुलना में आमतौर पर 25-28 ग्राम वजन वाले चूहों की तुलना में, जिनका अध्ययन 23,32,35,36 साहित्य में किया गया है, इस अध्ययन ने पेरिरेनल एडीपोज ऊतक की मात्रा को कम करने के लिए अपेक्षाकृत युवा और हल्के चूहों (8 सप्ताह पुराने और 21-23 ग्राम वजन) का उपयोग किया, जो परिधीय ऊतक विच्छेदन और संवहनी क्लैंप के उचित प्लेसमेंट की आवश्यकता के बिना गुर्दे और गुर्दे के पेडिकल्स को आसानी से उजागर कर सकते हैं। यह प्रक्रिया से संबंधित आघात और तकनीकी जटिलता को कम करेगा, संज्ञाहरण और सर्जरी की अवधि को कम करेगा, अध्ययन प्रक्रिया से अपरिचित लोगों के लिए सीखने की अवस्था को तेज करेगा, और अध्ययन की प्रजनन क्षमता में वृद्धि करेगा।
सामान्य संज्ञाहरण एक आईआर-एकेआई अध्ययन के परिणामों को प्रभावित करता है। लंबे समय तक संज्ञाहरणसर्जरी के दौरान जानवरों के नुकसान को बढ़ाता है। साहित्य में, फेनोबार्बिटल सोडियम, एक लंबे समय तक काम करने वाला बार्बिटुरेट जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को उदास करता है, को आईआर-एकेआई सर्जरी 26,33,35 के लिए चमड़े के नीचे प्रशासित किया गया है। फेनोबार्बिटल 5 मिनट के बाद सेट होता है और कम से कम 15 मिनट45 में सर्जिकल एनेस्थीसिया प्राप्त करने में मदद करता है। इसलिए, फेनोबार्बिटल को केवल कुशल सर्जनों द्वारा वितरित किया जाना चाहिए ताकि सर्जरी के दौरान संज्ञाहरण (>60 मिलीग्राम / किग्रा) और पशु हानि से बचा जासके। इसके विपरीत, इस अध्ययन के आइसोफ्लुरेन के उपयोग, जो एक गैर-ज्वलनशील साँस लेने वाले एनेस्थेटिक है, ने एक तेजी से शुरुआत को प्रेरित किया जिसने 7-10 मिनट में सर्जिकल संज्ञाहरण हासिल किया और साँस लेनारोकने के बाद 15 मिनट में प्रभाव बंद कर दिया। ऑक्सीजन के साथ संयोजन में आइसोफ्लुरेन का वितरण, ऑपरेटर के लिए सर्जरी के दौरान तुरंत शुरू करना, बनाए रखना और रोकना आसान है और गुर्दे की आईआर-एकेआई सर्जरी के लिए सुझाव दिया जाता है।
अंत में, गुर्दे के पेडिकल्स के पास जाने की विधि आईआर-एकेआई सर्जरी की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकती है। कुछ आईआर-एकेआई अध्ययनों ने मिडलाइन लैप्रोटॉमी का उपयोग करके गुर्दे के पेडिकल की जांच की है जहां पेट की गुहा खोली गई थी, और गुर्दे तक पहुंचने के लिए पेरिटोनियम और आंतों को एक तरफ धकेल दिया गया था। हालांकि, ऐसा करने से तरल पदार्थ और गर्मी की हानि, सर्जरी से संबंधित आघात और सर्जिकल अवधि32,35 बढ़ सकती है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल आईआर-एकेआई अनुसंधान के लिए एक डोरसोलेटरल दृष्टिकोण का सुझाव देता है ताकि शरीर के तापमान को बनाए रखने और सर्जरी से संबंधित चोट को कम करने के लिए फ्लैंक और रेट्रोपरिटोनियम से गुर्दे को उजागर किया जा सके, बाद में सर्जिकल स्थिति और अध्ययन स्थिरता में सुधार किया जा सके।
आरओएससी के बाद कार्डियक अरेस्ट के कारण द्विपक्षीय गुर्दे की क्षति के मार्करों की पहचान करने और चिह्नित करने के उद्देश्य से अध्ययन में इस मॉडल का एक संभावित अनुप्रयोग है। हालांकि, प्रक्रिया के दौरान सर्जिकल क्षति के कारण जारी साइटोकिन्स अध्ययन के परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं, जिससे वे नैदानिक परिदृश्य से संबंधित नहीं हो सकते हैं और अध्ययन के परिणामों के अनुवाद को बेंचसाइड से बेडसाइड तक सीमित कर सकते हैं।
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Disclosures
लेखक घोषणा करते हैं कि इस लेख के प्रकाशन के संबंध में हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
यह मॉडल विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय, ताइवान (MOST 109-2320-B-030-006-MY3) से वित्तीय सहायता के साथ विकसित किया गया था। इस पांडुलिपि को वालेस अकादमिक संपादन द्वारा संपादित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbable Suture, 6-0 | Ethicon | J510G-BX | |
| Betadine solution | Shineteh Istrument | ||
| Carprofen | Sigma | PHR1452 | |
| Cotton balls | Shineteh Istrument | ||
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Heating pad | Shineteh Istrument | ||
| Isoflurane | Piramal Critical Care Inc. | 26675-46-7 | |
| Moria Vessel Clamp | Fine Science Tools | 18320-11 | |
| Olsen-Hegar needle holder | Fine Science Tools | 12002 - 12 | |
| Saline | Shineteh Istrument | ||
| Scalpel blades | Shinva | s2646 | |
| Small Animal Anesthesia Machine | Sheng-Cing Instruments Co. | STEP AS-01 | |
| Tissue scissors | Fine Science Tools | 14072 - 10 |
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