Summary
В этом исследовании был разработан протокол, ориентированный на техническое усовершенствование мышиной модели двусторонней почечной ишемии-реперфузии для исследования острого повреждения почек.
Abstract
Остановка сердца представляет собой серьезное бремя для общественного здравоохранения. Острое повреждение почек (ОПП) является неблагоприятным маркером у людей, перенесших остановку сердца после восстановления спонтанного кровообращения (ROSC) после успешной сердечно-легочной реанимации. И наоборот, восстановление функции почек после ОПП является предиктором благоприятных неврологических исходов и выписки из стационара. Тем не менее, эффективное вмешательство для предотвращения повреждения почек, вызванного остановкой сердца после ROSC, отсутствует, что позволяет предположить, что требуются дополнительные терапевтические стратегии. Почечная гипоперфузия и реперфузия являются двумя патофизиологическими механизмами, которые вызывают ОПП после остановки сердца. Животные модели ишемически-реперфузионно-индуцированного ОПП (ИК-ОПП) обеих почек сопоставимы с пациентами с ОПП после РОСК в клинических условиях. Тем не менее, анализ ИК-ОПП обеих почек технически сложен, поскольку модель связана с высокой смертностью и широкими вариациями повреждения почек, что может повлиять на анализ. Были отобраны легкие мыши, помещены под общий наркоз изофлураном, подвергнуты хирургическому вмешательству с дорсолатеральным доступом, и температура их тела поддерживалась во время операции, тем самым уменьшая повреждение тканей и устанавливая воспроизводимый протокол исследования острого почечного ИК-ОПП.
Introduction
Остановка сердца происходит более 80 000 раз в годв Соединенных Штатах 1,2. Смертность от остановки сердца чрезвычайно высока 3,4,5,6. ОПП является основным фактором риска, связанным с высокой смертностью и неблагоприятными неврологическими исходами у пациентов с остановкой сердца после ROSC 7,8,9,10,11,12,13. Выздоровление после ОПП является хорошим предиктором благоприятных неврологических исходов и выписки из стационара14,15,16. Тем не менее, эффективные методы лечения ИК-ОПП до сих пор отсутствуют 15,16,17,18,19. Для дальнейшего улучшения клинических исходов заболевания требуются дополнительные терапевтические стратегии.
ИК-ОПП с двусторонней ишемией почки является одной из животных моделей, используемых для исследования ОПП 20,21,22,23,24,25,26. Модели ИК-ОПП почек на животных менее сложны, чем модель ИК-повреждения всего тела для изучения ОПП у пациентов с внезапной остановкой сердца после ROSC 6,27,28,29,30. Это означает, что стабильных результатов на почечной модели ИК-ОПП на животных легче достичь из-за наличия меньшего количества искажающих факторов в экспериментах. Кроме того, протоколы ИК-ОПП почек обычно включают одностороннюю или двустороннюю окклюзию ножки почки. Условия в экспериментах по двустороннему почечному ИК-ОПП сопоставимы с клиническими условиями ОПП после ROSC у пациентов с внезапной остановкой сердца после успешной сердечно-легочной реанимации. Несмотря на то, что патологические характеристики почек в обеих моделях отражают патологические характеристики ИР-повреждения почек человека 31,32,33, подход с двусторонней ишемией почек более актуален для ОПП при патологических состояниях человека, таких как сердечная недостаточность, вазоконстрикция и септический шок 35. Двусторонние почечные модели ИК-ОПП на животных подходят для исследований, посвященных почечным ИК-повреждениям при остановке сердца после ROSC.
Двусторонние почечные модели ИК-ОПП связаны с техническими трудностями, сложностью эксперимента и длительностью операции 23,26,32,33,35,36. Для преодоления этих технических трудностей в настоящем исследовании был разработан надежный протокол двустороннего исследования ИК-ОПП на мышах путем внесения некоторых технических изменений. Предложенный протокол привел к меньшему количеству хирургических осложнений, меньшему повреждению тканей и снижению вероятности летальности во время операции. Таким образом, он может быть использован для изучения патофизиологических процессов ОПП после ROSC для разработки новых терапевтических стратегий против гипоперфузионного и реперфузионного поврежденияпочек 37,38,39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованным Национальными институтами здравоохранения США (публикация NIH No 85-23, пересмотрена в 1996 году). Протокол исследования был одобрен и в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу за животными и их использованию при Католическом университете Фу-Жэнь. Подробные сведения обо всех материалах и инструментах, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов .
1. Подготовка мышей
- Выберите 8-недельных мышей-самцов C57BL/6 весом 21-23 г.
- Содержате и содержате мышей в течение 12-часового цикла света и темноты при контролируемой температуре (21 ± 2 °C) со свободным доступом к пище, стандартным гранулам корма для мышей и водопроводной воде.
2. Анестезия
- Наденьте хирургическую маску и стерильные перчатки.
- Вводят мышей под наркоз 2% изофлураном, смешанным с кислородом со скоростью 1 л/мин в индукционной камере.
- Оценивают уровень анестезии по педальному рефлексу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Педальный рефлекс - это втягивание задней лапы в ответ на сильное сжатие пальца ноги. Обезболивание завершается, когда педальный рефлекс исчезает. - Переместите и поместите каждую мышь в положение лежа на операционной платформе с электрическим одеялом, чтобы поддерживать температуру тела после завершения анестезии. Стабилизируйте температуру тела перед операцией и контролируйте с помощью ректальных температурных датчиков. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость.
- Примотайте лапки мышей скотчем к доске.
- Прикрепите маску к лицу мышей, чтобы обеспечить постоянную подачу 1% изофлурана и 1 л/мин кислорода
- Регулярно оценивайте уровень анестезии с помощью педального рефлекса и соответствующим образом регулируйте подачу анестетика во время операции.
3. Двусторонняя почечная ИК-ОПП операция
- Прикоснитесь к спине и найдите поясничный отдел позвоночника мышей вручную. Двигайтесь вдоль позвоночника цефалически и ищите реберно-вертебральные углы, которые находятся ниже обеих сторон от последнего ребра мышей.
- Нанесите лосьон для удаления волос на обе стороны области реберно-вертебрального угла примерно на 30 с, а затем удалите шерсть с помощью физиологического раствора.
- Продезинфицируйте выбритую кожу тремя циклами раствора бетадина и 75% спирта с помощью ватных шариков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание стерильного поля для операции на протяжении всей процедуры является ключевым моментом. Наложите хирургическую простыню и используйте стерильные инструменты. - Используйте щипцы с тонким наконечником, чтобы осторожно приподнять кожу ниже левого реберно-овертебрального угла, а затем с помощью ножниц сделайте косой дорсолатеральный разрез длиной 1 см вдоль линий натяжения кожи от поясничной средней линии на левом боку. Разрежьте мышечную стенку левого бока с помощью ножниц, чтобы визуализировать левую почку.
- Повторите вышеупомянутые хирургические процедуры, чтобы визуализировать правую почку. Небольшое количество крови, образующейся во время процедуры, удалить стерильными ватными палочками.
- Осторожно надавите и отделите левую почку от окружающих тканей щипцами. Определите ножку почки после обнажения левой почки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить надпочечники и окружающие кровеносные сосуды. - Зажать левую почечную ножку микрососудистым зажимом на 25 мин. Подтверждают ишемию видимым изменением цвета почек от розового до темно-красного.
- Накройте зажатую почку стерильными влажными ватными шариками с физиологическим раствором, чтобы избежать пересыхания во время пережатия ножки левой почки.
- Повторите вышеупомянутые хирургические процедуры, чтобы пережать правую почечную ножку микроваскулярным зажимом на 25 минут.
- Накройте зажатую почку стерильными влажными ватными шариками с физиологическим раствором, чтобы избежать пересыхания во время пережатия правой почечной ножки.
- Периодически контролируйте глубину анестезии и влажность стерильных ватных шариков с физиологическим раствором.
- Откройте левый микрососудистый зажим, чтобы начать реперфузию левой почки. Подтвердить реперфузию можно видимым изменением цвета левой почки от темно-красного до розового.
- Откройте правый микрососудистый зажим, чтобы начать реперфузию правой почки.
- После того, как изменение цвета почки будет подтверждено, верните почку в брюшную полость.
- Закройте брюшную полость и кожу рассасывающимися шовными материалами 6-0.
- Продезинфицируйте рану раствором бетадина и 75% спиртом с помощью ватных тампонов.
- Внимательно наблюдайте за животным, пока оно не начнет свободно двигаться и кормиться.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайте пристальное внимание на животных до тех пор, пока они не придут в сознание, достаточное для поддержания положения грудины. - Назначают карпрофен (5 мг/кг в 0,2 мл, вводят подкожно) в течение 2-3 дней для профилактики послеоперационной боли.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Перед дальнейшим микроскопическим или молекулярным анализом необходимо оценить качество двусторонней почечной операции ИК-ОПП. Во время операции ишемия почки должна быть подтверждена путем наблюдения за тем, изменила ли почка цвет с розового на темно-красный вскоре после того, как ножка почки была пережата микрососудистым зажимом (рис. 1). После операции повреждение почек, вызванное операцией IR-AKI, может быть дополнительно подтверждено с помощью нескольких микролитров сыворотки путем забора подчелюстной крови для биохимического анализа, где результаты указывают на повышение уровня азота мочевины крови и креатинина по сравнению с исходным уровнем (Рисунок 2).
Рисунок 1: Ишемия почки после пережатия ножки почки. Изменение цвета почек с розового на темно-красный, что указывает на то, что перфузия почек стала недостаточной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Почечная недостаточность после двусторонней операции ИК-ОПП. Уровень азота мочевины и креатинина в сыворотке крови повышался через 2 дня после почечной реперфузии. Сокращения: IR-AKI = острое повреждение почек, вызванное ишемией-реперфузией; МОЧЕВИНА = азот мочевины крови; I/R = ишемия-реперфузия (n = 4, *p < 0,05 по сравнению с контролем). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Предлагаемый двусторонний протокол ИК-ОПП подходит для изучения механизма гипоперфузионного и реперфузионного повреждения обеих почек. Протокол предполагает, что легкие мыши, общая анестезия изофлураном, дорсолатеральный подход к операции и поддержание температуры тела во время операции смягчают связанные с этим технические трудности, сокращают продолжительность операции и повышают согласованность процедуры исследования острого двустороннего почечного ИК-ОПП.
Технические трудности влияют на тяжесть повреждения почек при двусторонней операции ИК-ОППпочек 33. В дополнение к мышиному напряжению, полу, возрасту и системам нагрева 36,40,41,42,43,44, правильное размещение сосудистого зажима имеет важное значение для получения стабильных результатов. Исследования рекомендуют тщательное рассечение окружающей жировой ткани для высвобождения почек и почечных ножек или артерий 23,26,32,35,36. По сравнению с мышами в возрасте 8-20 недель, обычно весом 25-28 г, которые были изучены в литературе 23,32,35,36, в этом исследовании использовались относительно молодые и легкие мыши (в возрасте 8 недель и весом 21-23 г) для уменьшения количества околопочечной жировой ткани, которая могла легко обнажить почки и ножки почек, не требуя рассечения периферических тканей и правильной установки сосудистых зажимов. Это уменьшит травматичность, связанную с процедурой, и техническую сложность, сократит продолжительность анестезии и операции, ускорит обучение для тех, кто не знаком с процедурой исследования, и повысит воспроизводимость исследования.
Общая анестезия влияет на результаты исследования ИК-ОПП. Длительная анестезия увеличивает потери животного во время операции33. В литературе фенобарбитал натрия, барбитурат длительного действия, угнетающий центральную нервную систему, вводился подкожно для операции ИК-ОПП 26,33,35. Фенобарбитал вступает в действие через 5 мин и помогает достичь хирургического обезболивания не менее чем через 15 мин45. Поэтому фенобарбитал должен назначаться только квалифицированными хирургами, чтобы избежать продления анестезии (>60 мг/кг) и потери животного во время операции33. Напротив, в этом исследовании использование изофлурана, который является негорючим ингаляционным анестетиком, вызывало быстрое начало, которое достигало хирургической анестезии через 7-10 минут и прекращало эффект через 15 минут после прекращения ингаляции. Подача изофлурана в сочетании с кислородом легко запускается, поддерживается и останавливается оператором во время операции и рекомендуется для почечной операции IR-AKI.
Наконец, способ приближения к ножкам почек может повлиять на качество операции ИК-ОПП. В некоторых исследованиях IR-AKI изучали ножку почки с помощью срединной лапаротомии, при которой брюшная полость была вскрыта, а брюшина и кишечник отодвинуты в сторону для доступа к почке. Тем не менее, это может увеличить потерю жидкости и тепла, травму, связанную с операцией, и продолжительность операции32,35. Таким образом, этот протокол предлагает дорсолатеральный подход к исследованию ИК-ОПП, чтобы обнажить почку с фланга и забрюшинного пространства для поддержания температуры тела и минимизации травмы, связанной с операцией, что впоследствии улучшает хирургическое состояние и последовательность исследования.
Эта модель имеет потенциальное применение в исследованиях, направленных на выявление и характеристику маркеров двустороннего повреждения почек, вызванного остановкой сердца после ROSC. Тем не менее, цитокины, высвобождаемые из-за хирургического повреждения во время процедуры, могут влиять на результаты исследования, делая их несоответствующими клиническому сценарию и ограничивая перенос результатов исследования с постели больного.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в связи с публикацией данной статьи.
Acknowledgments
Эта модель была разработана при финансовой поддержке Министерства науки и технологий Тайваня (MOST 109-2320-B-030-006-MY3). Эта рукопись была отредактирована Wallace Academic Editing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbable Suture, 6-0 | Ethicon | J510G-BX | |
| Betadine solution | Shineteh Istrument | ||
| Carprofen | Sigma | PHR1452 | |
| Cotton balls | Shineteh Istrument | ||
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Heating pad | Shineteh Istrument | ||
| Isoflurane | Piramal Critical Care Inc. | 26675-46-7 | |
| Moria Vessel Clamp | Fine Science Tools | 18320-11 | |
| Olsen-Hegar needle holder | Fine Science Tools | 12002 - 12 | |
| Saline | Shineteh Istrument | ||
| Scalpel blades | Shinva | s2646 | |
| Small Animal Anesthesia Machine | Sheng-Cing Instruments Co. | STEP AS-01 | |
| Tissue scissors | Fine Science Tools | 14072 - 10 |
References
- Holmberg, M. J., et al. Annual incidence of adult and pediatric in-hospital cardiac arrest in the United States. Circulation: Cardiovascular Quality and Outcomes. 12 (7), 005580 (2019).
- Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2018 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 137 (12), 67 (2018).
- Lascarrou, J. B., et al. Targeted temperature management for cardiac arrest with nonshockable rhythm. The New England Journal of Medicine. 381 (24), 2327-2337 (2019).
- Chang, H. C., et al. Factors affecting outcomes in patients with cardiac arrest who receive target temperature management: The multi-center TIMECARD registry. Journal of the Formosan Medical Association. 121 (1), 294-303 (2022).
- Yu, G., et al. Comparison of the survival and neurological outcomes in OHCA based on smoking status: investigation of the existence of the smoker's paradox. Signa Vitae. 18 (2), 121-129 (2022).
- Chen, Y. C., et al. Major interventions are associated with survival of out of hospital cardiac arrest patients - a population based survey. Signa Vitae. 13 (2), 108-115 (2017).
- Sandroni, C., et al. Acute kidney injury after cardiac arrest: a systematic review and meta-analysis of clinical studies. Minerva Anestesiologica. 82 (9), 989-999 (2016).
- Patyna, S., et al. Acute kidney injury after in-hospital cardiac arrest in a predominant internal medicine and cardiology patient population: incidence, risk factors, and impact on survival. Renal Failure. 43 (1), 1163-1169 (2021).
- Storm, C., et al. Impact of acute kidney injury on neurological outcome and long-term survival after cardiac arrest - A 10 year observational follow up. Journal of Critical Care. 47, 254-259 (2018).
- Geri, G., et al. Acute kidney injury after out-of-hospital cardiac arrest: risk factors and prognosis in a large cohort. Intensive Care Medicine. 41 (7), 1273-1280 (2015).
- Guo, Q. Y., Xu, J., Shi, Q. D. Gasping as a predictor of short- and long-term outcomes in patients with cardiac arrest: a systematic review and meta-analysis. Signa Vitae. 17 (2), 208-213 (2021).
- Chen, P. C., et al. Prognostic factors for adults with cardiac arrest in the emergency department: a retrospective cohort study. Signa Vitae. 18 (3), 56-64 (2022).
- Lee, M. J., et al. Predictors of survival and good neurological outcomes after in-hospital cardiac arrest. Signa Vitae. 17 (2), 67-76 (2021).
- Deakin, C. D., et al. European Resuscitation Council guidelines for resuscitation 2010 section 4. adult advanced life support. Resuscitation. 81 (10), 1305-1352 (2010).
- Cha, K. C., et al. Recovery from acute kidney injury is an independent predictor of survival at 30 days only after out-of-hospital cardiac arrest who were treated by targeted temperature management. Signa Vitae. 17 (2), 119-126 (2021).
- Park, Y. S., et al. Recovery from acute kidney injury as a potent predictor of survival and good neurological outcome at discharge after out-of-hospital cardiac arrest. Critical Care. 23 (1), 256 (2019).
- Mah, K. E., et al. Acute kidney injury after in-hospital cardiac arrest. Resuscitation. 160, 49-58 (2021).
- Pelkey, T. J., et al. Minimal physiologic temperature variations during renal ischemia alter functional and morphologic outcome. Journal of Vascular Surgery. 15 (4), 619-625 (1992).
- Kim, H., et al. Effect of different combinations of initial body temperature and target temperature on neurological outcomes in out-of-hospital cardiac arrest patients treated with targeted temperature management. Signa Vitae. , 1-7 (2022).
- Wyss, J. C., et al. Differential effects of the mitochondria-active tetrapeptide SS-31 (D-Arg-dimethylTyr-Lys-Phe-NH2) and its peptidase-targeted prodrugs in experimental acute kidney injury. Frontiers in Pharmacology. 10, 1209 (2019).
- Wang, Y., Wang, B., Qi, X., Zhang, X., Ren, K. Resveratrol protects against post-contrast acute kidney injury in rabbits with diabetic nephropathy. Frontiers in Pharmacology. 10, 833 (2019).
- Li, S., Yu, L., He, A., Liu, Q. Klotho inhibits unilateral ureteral obstruction-induced endothelial-to-mesenchymal transition via TGF-beta1/Smad2/Snail1 signaling in mice. Frontiers in Pharmacology. 10, 348 (2019).
- Godoy, J. R., Watson, G., Raspante, C., Illanes, O. An effective mouse model of unilateral renal ischemia-reperfusion injury. Journal of Visualized Experiments. (173), e62749 (2021).
- Chen, Q., et al. SIRT1 mediates effects of FGF21 to ameliorate cisplatin-induced acute kidney injury. Frontiers in Pharmacology. 11, 241 (2020).
- Li, H. D., et al. Application of herbal traditional Chinese medicine in the treatment of acute kidney injury. Frontiers in Pharmacology. 10, 376 (2019).
- Grenz, A., et al. Use of a hanging-weight system for isolated renal artery occlusion during ischemic preconditioning in mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292, 475-485 (2007).
- Gao, Q., et al. Accumulated epinephrine dose is associated with acute kidney injury following resuscitation in adult cardiac arrest patients. Frontiers in Pharmacology. 13, 806592 (2022).
- Oh, Y. T., et al. Vasoactive-inotropic score as a predictor of in-hospital mortality in out-of-hospital cardiac arrest. Signa Vitae. 15 (2), 40-44 (2019).
- Burne-Taney, M. J., et al. Acute renal failure after whole body ischemia is characterized by inflammation and T cell-mediated injury. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 285 (1), 87-94 (2003).
- Adams, J. A., et al. Periodic acceleration (pGz) prior to whole body ischemia reperfusion injury provides early cardioprotective preconditioning. Life Sciences. 86 (19-20), 707-715 (2010).
- Gaut, J. P., Liapis, H. Acute kidney injury pathology and pathophysiology: a retrospective review. Clinical Kidney Journal. 14 (2), 526-536 (2021).
- Hesketh, E. E., et al. Renal ischaemia reperfusion injury: a mouse model of injury and regeneration. Journal of Visualized Experiments. (88), e51816 (2014).
- Wei, Q., Dong, Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (11), 1487-1494 (2012).
- Wei, Q., Dong, Z. Regulation and pathological role of bid in ischemic acute kidney injury. Renal Failure. 29 (8), 935-940 (2007).
- Grenz, A., et al. Use of a hanging-weight system for isolated renal artery occlusion. Journal of Visualized Experiments. (53), e2549 (2011).
- Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. Journal of Visualized Experiments. (78), e50495 (2013).
- Han, S. J., Lee, H. T. Mechanisms and therapeutic targets of ischemic acute kidney injury. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (4), 427-440 (2019).
- Huang, C. W., et al. A novel caffeic acid derivative prevents renal remodeling after ischemia/reperfusion injury. Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112028 (2021).
- Spoelstra-de Man, A. M. E., Oudemans-van Straaten, H. M. Acute kidney injury after cardiac arrest: the role of coronary angiography and temperature management. Critical Care. 23 (1), 193 (2019).
- Burne, M. J., Haq, M., Matsuse, H., Mohapatra, S., Rabb, H. Genetic susceptibility to renal ischemia reperfusion injury revealed in a murine model. Transplantation. 69 (5), 1023-1025 (2000).
- Muller, V., et al. Sexual dimorphism in renal ischemia-reperfusion injury in rats: possible role of endothelin. Kidney International. 62 (4), 1364-1371 (2002).
- Schmitt, R., Marlier, A., Cantley, L. G. Zag expression during aging suppresses proliferation after kidney injury. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (12), 2375-2383 (2008).
- Oxburgh, L., de Caestecker, M. P.
- Delbridge, M. S., Shrestha, B. M., Raftery, A. T., El Nahas, A. M., Haylor, J. L. The effect of body temperature in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation Proceedings. 39 (10), 2983-2985 (2007).
- IBM Micromedx, I. Phenobarbital sodium. IBM Corporation. , Available from: https://www-micromedexsolutions-com.autorpa.mmh.org.tw/micromedex2/librarian/CS/53C834/ND_PR/evidencexpert/ND_P/evidencexpert/DUPLICATIONSHIELDSYNC/51EFF0/ND_PG/evidencexpert/ND_B/evidencexpert/ND_AppProduct/evidencexpert/ND_T/evidencexpert/PFActionId/evidencexpert.DoIntegratedSearch?SearchTerm=Phenobarbital+Sodium&fromInterSaltBase=true&UserMdxSearchTerm=%24userMdxSearchTerm&false=null&=null# (2022).
- IBM Micromedx, Isoflurane. IBM Corporation. , Available from: https://www-micromedexsolutions-com.autorpa.mmh.org.tw/micromedex2/librarian/PFDefaultActionId/evidencexpert.DoIntegratedSearch?navitem=headerLogout# (2022).
