Summary
Questo studio ha stabilito un protocollo incentrato sul perfezionamento tecnico di un modello murino di ischemia-riperfusione renale bilaterale per la ricerca sul danno renale acuto.
Abstract
L'arresto cardiaco rappresenta un grande onere per la salute pubblica. Il danno renale acuto (AKI) è un marcatore avverso nei sopravvissuti all'arresto cardiaco a seguito del ritorno della circolazione spontanea (ROSC) dopo una rianimazione cardiopolmonare riuscita. Al contrario, il recupero della funzione renale dall'AKI è un predittore di esiti neurologici favorevoli e di dimissione dall'ospedale. Tuttavia, manca un intervento efficace per prevenire il danno renale causato dall'arresto cardiaco dopo ROSC, suggerendo che sono necessarie ulteriori strategie terapeutiche. L'ipoperfusione renale e la riperfusione sono due meccanismi fisiopatologici che causano l'AKI dopo l'arresto cardiaco. I modelli animali di AKI indotta da ischemia-riperfusione (IR-AKI) di entrambi i reni sono paragonabili a quelli dei pazienti con AKI dopo ROSC in un contesto clinico. Tuttavia, l'IR-AKI di entrambi i reni è tecnicamente difficile da analizzare perché il modello è associato a un'elevata mortalità e a un'ampia variazione del danno renale, che può influenzare l'analisi. Sono stati scelti topi leggeri, posti in anestesia generale con isoflurano, sottoposti a chirurgia con approccio dorsolaterale e la loro temperatura corporea mantenuta durante l'operazione, riducendo così il danno tissutale e stabilendo un protocollo di ricerca IR-AKI renale acuto riproducibile.
Introduction
L'arresto cardiaco si verifica più di 80.000 volte all'anno negli Stati Uniti 1,2. Il tasso di mortalità per arresto cardiaco è estremamente alto 3,4,5,6. L'AKI è un importante fattore di rischio associato a un'elevata mortalità e a scarsi esiti neurologici nei pazienti con arresto cardiaco dopo ROSC 7,8,9,10,11,12,13. Il recupero dall'AKI è un buon predittore di esiti neurologici favorevoli e dimissione dall'ospedale14,15,16. Tuttavia, mancano ancora terapie efficaci per IR-AKI 15,16,17,18,19. Sono necessarie ulteriori strategie terapeutiche per migliorare ulteriormente gli esiti clinici della malattia.
L'IR-AKI con approccio di ischemia renale bilaterale è uno dei modelli animali utilizzati per la ricerca sull'AKI 20,21,22,23,24,25,26. I modelli animali IR-AKI renali sono meno complicati di un modello di lesione IR di tutto il corpo per lo studio dell'AKI in pazienti con arresto cardiaco improvviso dopo ROSC 6,27,28,29,30. Ciò implica che i risultati coerenti di un modello animale IR-AKI renale sono più facili da ottenere a causa della presenza di un minor numero di fattori confondenti negli esperimenti. Inoltre, i protocolli renali IR-AKI comportano comunemente un'occlusione peduncolare renale unilaterale o bilaterale. Le condizioni negli esperimenti sull'IR-AKI renale bilaterale sono paragonabili alle condizioni cliniche per l'AKI dopo ROSC in pazienti con arresto cardiaco improvviso dopo rianimazione cardiopolmonare riuscita. Sebbene le caratteristiche patologiche dei reni in entrambi i modelli riflettano le caratteristiche patologiche del danno IR renale umano 31,32,33, un approccio di ischemia renale bilaterale è più rilevante per l'AKI in condizioni patologiche umane, come insufficienza cardiaca, vasocostrizione e shock settico 35. I modelli animali IR-AKI renali bilaterali sono adatti per studi incentrati sulle lesioni IR renali nell'arresto cardiaco dopo ROSC.
I modelli IR-AKI renali bilaterali sono associati a difficoltà tecniche, complessità sperimentale e lunga durata dell'intervento chirurgico 23,26,32,33,35,36. Per superare queste difficoltà tecniche, il presente studio ha stabilito un protocollo di ricerca bilaterale IR-AKI affidabile nei topi apportando alcune modifiche tecniche. Il protocollo proposto ha portato a un minor numero di complicanze chirurgiche, a un minor danno tissutale e a una minore probabilità di mortalità durante l'intervento chirurgico. Pertanto, può essere utilizzato per studiare i processi fisiopatologici dell'AKI dopo ROSC per sviluppare nuove strategie terapeutiche contro l'ipoperfusione renale e il danno da riperfusione37,38,39.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, pubblicata dal National Institutes of Health degli Stati Uniti (pubblicazione NIH n. 85-23, rivista nel 1996). Il protocollo di studio è stato approvato e in conformità con le linee guida del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali presso l'Università Cattolica di Fu-Jen. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.
1. Preparare i topi
- Selezionare topi maschi C57BL/6 di 8 settimane con un peso di 21-23 g.
- Alloggiare e mantenere i topi in un ciclo di luce e buio di 12 ore a temperatura controllata (21 ± 2 °C) con libero accesso al cibo, ai pellet di cibo standard per topi e all'acqua del rubinetto.
2. Anestesia
- Indossare una mascherina chirurgica e guanti sterili.
- Mettere i topi sotto anestesia con isoflurano al 2% miscelato con ossigeno a 1 L/min nella camera di induzione.
- Valutare il livello di anestesia mediante riflesso del pedale.
NOTA: Il riflesso del pedale è una retrazione della zampa posteriore in risposta a un forte pizzicamento della punta del piede. L'anestesia è completa quando il riflesso del pedale scompare. - Sposta e posiziona ogni topo in posizione prona su una piattaforma chirurgica con una coperta elettrica per mantenere la temperatura corporea una volta completata l'anestesia. Stabilizzare la temperatura corporea prima dell'intervento chirurgico e monitorare con sonde di temperatura rettale. Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza.
- Attacca le zampe dei topi alla tavola.
- Applicare una maschera al muso dei topi per fornire un apporto costante di isoflurano all'1% e 1 L/min di ossigeno
- Valutare regolarmente il livello di anestesia mediante riflesso del pedale e regolare di conseguenza l'erogazione dell'anestetico durante l'intervento.
3. Chirurgia renale bilaterale IR-AKI
- Tocca la schiena e trova manualmente la colonna lombare dei topi. Muoviti lungo la colonna vertebrale cefalicamente e cerca gli angoli costovertebrali che si trovano sotto entrambi i lati dell'ultima costola dei topi.
- Applicare la lozione depilatoria su entrambi i lati della regione dell'angolo costovertebrale per circa 30 secondi e poi rimuovere il pelo con soluzione fisiologica.
- Disinfettare la pelle rasata con tre giri di soluzione di betadine e alcol al 75% utilizzando batuffoli di cotone.
NOTA: Mantenere un campo sterile per l'intervento chirurgico durante tutta la procedura è fondamentale. Applicare un telo chirurgico e utilizzare strumenti sterili. - Usa una pinza a punta fine per sollevare delicatamente la pelle al di sotto dell'angolo costovertebrale sinistro, quindi usa le forbici per creare un'incisione dorsolaterale obliqua di 1 cm lungo le linee di tensione della pelle dalla linea mediana lombare sul fianco sinistro. Attraversa la parete muscolare del fianco sinistro usando le forbici per visualizzare il rene sinistro.
- Ripetere le procedure chirurgiche di cui sopra per visualizzare il rene destro. Rimuovere le piccole quantità di sangue prodotte durante la procedura con tamponi di cotone sterili.
- Spingere e separare con cautela il rene sinistro dal tessuto circostante con una pinza. Identificare il peduncolo renale dopo che il rene sinistro è stato esposto.
NOTA: Fare attenzione a non danneggiare la ghiandola surrenale e i vasi sanguigni circostanti. - Pinza sul peduncolo renale sinistro con una clip microvascolare per 25 minuti. Confermare l'ischemia con un cambiamento visibile nel colore del rene da rosa a rosso scuro.
- Coprire il rene clampato con batuffoli di cotone umidi con soluzione fisiologica sterile per evitare l'essiccazione durante il clampaggio del peduncolo renale sinistro.
- Ripetere le procedure chirurgiche di cui sopra per bloccare il peduncolo renale destro con una clip microvascolare per 25 minuti.
- Coprire il rene clampato con batuffoli di cotone umidi con soluzione fisiologica sterile per evitare l'essiccazione durante il clampaggio del peduncolo renale destro.
- Monitorare periodicamente la profondità dell'anestesia e l'umidità dei batuffoli di cotone umidi con soluzione salina sterile.
- Aprire la clip microvascolare sinistra per avviare la riperfusione del rene sinistro. Confermare la riperfusione con un visibile cambiamento di colore del rene sinistro da rosso scuro a rosa.
- Aprire la clip microvascolare destra per avviare la riperfusione del rene destro.
- Dopo aver verificato il cambiamento di colore del rene, riportare il rene nella cavità addominale.
- Chiudere la cavità addominale e la pelle con materiali di sutura riassorbibili 6-0.
- Strofinare per disinfettare la ferita con una soluzione di betadine e alcol al 75% utilizzando batuffoli di cotone.
- Osserva attentamente l'animale fino a quando non inizia a muoversi liberamente e a nutrirsi.
NOTA: Prestare molta attenzione agli animali fino a quando non hanno ripreso coscienza a sufficienza per mantenere il decubito sternale. - Somministrare carprofene (5 mg/kg in 0,2 ml, somministrato per via sottocutanea) per 2-3 giorni per prevenire il dolore post-chirurgico.
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Representative Results
La qualità della chirurgia renale bilaterale IR-AKI deve essere valutata prima di ulteriori analisi microscopiche o molecolari. Durante l'intervento chirurgico, l'ischemia renale deve essere confermata osservando se il rene ha cambiato colore da rosa a rosso scuro subito dopo che il peduncolo renale è stato bloccato con una clip microvascolare (Figura 1). Dopo l'intervento chirurgico, il danno renale causato dalla chirurgia IR-AKI può essere ulteriormente convalidato con alcuni microlitri di siero attraverso la raccolta di sangue sottomandibolare per l'analisi biochimica in cui i risultati indicano un aumento del livello di azoto ureico e creatinina nel sangue rispetto al basale (Figura 2).
Figura 1: Ischemia renale dopo clampaggio peduncolare renale. Un cambiamento di colore del rene dal rosa al rosso scuro rivela che la perfusione renale è diventata inadeguata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Insufficienza renale dopo chirurgia bilaterale IR-AKI. I livelli sierici di azoto ureico e creatinina nel sangue sono aumentati 2 giorni dopo la riperfusione renale. Abbreviazioni: IR-AKI = danno renale acuto indotto da ischemia-riperfusione; BUN = azoto ureico nel sangue; I/R = ischemia-riperfusione (n = 4, *p < 0,05 rispetto al controllo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo bilaterale IR-AKI proposto è adatto per studiare il meccanismo di ipoperfusione e riperfusione di entrambi i reni. Il protocollo suggerisce che i topi leggeri, l'anestesia generale con isoflurano, un approccio dorsolaterale all'intervento chirurgico e il mantenimento della temperatura corporea durante l'operazione mitigano le difficoltà tecniche associate, riducano la durata dell'intervento chirurgico e aumentino la coerenza della procedura per la ricerca IR-AKI renale bilaterale acuta.
Le difficoltà tecniche influenzano la gravità del danno renale nella chirurgia bilaterale IR-AKIrenale 33. Oltre al ceppo, al sesso, all'età e ai sistemi di riscaldamento dei topi 36,40,41,42,43,44, il corretto posizionamento della pinza vascolare è essenziale per ottenere risultati coerenti. Gli studi hanno raccomandato un'attenta dissezione del tessuto adiposo circostante per liberare il rene e i peduncoli renali o le arterie 23,26,32,35,36. Rispetto ai topi di età compresa tra 8 e 20 settimane di età che pesano tipicamente 25-28 g e che sono stati studiati in letteratura 23,32,35,36, questo studio ha utilizzato topi relativamente giovani e leggeri (8 settimane di età e del peso di 21-23 g) per ridurre la quantità di tessuto adiposo perirenale, che potrebbe esporre facilmente i peduncoli renali e renali senza richiedere la dissezione del tessuto periferico e il corretto posizionamento delle pinze vascolari. Ciò ridurrebbe i traumi correlati alla procedura e la complessità tecnica, ridurrebbe la durata dell'anestesia e dell'intervento chirurgico, accelererebbe la curva di apprendimento per coloro che non hanno familiarità con la procedura di studio e aumenterebbe la riproducibilità dello studio.
L'anestesia generale influenza i risultati di uno studio IR-AKI. L'anestesia prolungata aumenta la perdita di animali durante l'intervento chirurgico33. In letteratura, il fenobarbital sodico, un barbiturico a lunga durata d'azione che deprime il sistema nervoso centrale, è stato somministrato per via sottocutanea per la chirurgia IR-AKI 26,33,35. Il fenobarbital entra in azione dopo 5 minuti e aiuta a ottenere l'anestesia chirurgica in almeno 15 minuti45. Pertanto, il fenobarbital deve essere somministrato solo da chirurghi esperti per evitare il prolungamento dell'anestesia (>60 mg/kg) e la perdita di animali durante l'intervento chirurgico33. Al contrario, l'uso dell'isoflurano in questo studio, che è un anestetico per via inalatoria non infiammabile, ha indotto una rapida insorgenza che ha raggiunto l'anestesia chirurgica in 7-10 minuti e ha cessato l'effetto in 15 minuti dopo aver interrotto l'inalazione46. L'erogazione di isoflurano, in combinazione con l'ossigeno, è facile da avviare, mantenere e arrestare istantaneamente per l'operatore durante l'intervento chirurgico ed è consigliata per la chirurgia IR-AKI renale.
Infine, il metodo di approccio ai peduncoli renali può influenzare la qualità della chirurgia IR-AKI. Alcuni studi IR-AKI hanno indagato il peduncolo renale utilizzando la laparotomia della linea mediana in cui la cavità addominale è stata aperta e il peritoneo e l'intestino sono stati spinti da parte per accedere al rene. Tuttavia, ciò può aumentare la perdita di liquidi e calore, il trauma correlato all'intervento chirurgico e la durata dell'intervento chirurgico32,35. Pertanto, questo protocollo suggerisce un approccio dorsolaterale per la ricerca IR-AKI per esporre il rene dal fianco e il retroperitoneo per mantenere la temperatura corporea e ridurre al minimo il danno correlato all'intervento chirurgico, migliorando successivamente la condizione chirurgica e la coerenza dello studio.
Questo modello ha una potenziale applicazione in studi volti a identificare e caratterizzare i marcatori di danno renale bilaterale causato da arresto cardiaco a seguito di ROSC. Tuttavia, le citochine rilasciate a causa del danno chirurgico durante la procedura possono influenzare i risultati dello studio, rendendoli non correlati allo scenario clinico e limitando la traduzione dei risultati dello studio dal banco al letto del paziente.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi per quanto riguarda la pubblicazione di questo articolo.
Acknowledgments
Questo modello è stato sviluppato con il sostegno finanziario del Ministero della Scienza e della Tecnologia di Taiwan (MOST 109-2320-B-030-006-MY3). Questo manoscritto è stato curato da Wallace Academic Editing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbable Suture, 6-0 | Ethicon | J510G-BX | |
| Betadine solution | Shineteh Istrument | ||
| Carprofen | Sigma | PHR1452 | |
| Cotton balls | Shineteh Istrument | ||
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Heating pad | Shineteh Istrument | ||
| Isoflurane | Piramal Critical Care Inc. | 26675-46-7 | |
| Moria Vessel Clamp | Fine Science Tools | 18320-11 | |
| Olsen-Hegar needle holder | Fine Science Tools | 12002 - 12 | |
| Saline | Shineteh Istrument | ||
| Scalpel blades | Shinva | s2646 | |
| Small Animal Anesthesia Machine | Sheng-Cing Instruments Co. | STEP AS-01 | |
| Tissue scissors | Fine Science Tools | 14072 - 10 |
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