Summary
Denne undersøgelse etablerede en protokol med fokus på den tekniske forfining af en musemodel af bilateral renal iskæmi-reperfusion til forskning i akut nyreskade.
Abstract
Hjertestop udgør en stor folkesundhedsbyrde. Akut nyreskade (AKI) er en negativ markør hos overlevende efter hjertestop efter tilbagevenden af spontan cirkulation (ROSC) efter vellykket hjerte-lungeredning. Omvendt er genopretning af nyrefunktion fra AKI en forudsigelse for gunstige neurologiske resultater og hospitalsudskrivning. Imidlertid mangler en effektiv intervention for at forhindre nyreskade forårsaget af hjertestop efter ROSC, hvilket tyder på, at der kræves yderligere terapeutiske strategier. Renal hypoperfusion og reperfusion er to patofysiologiske mekanismer, der forårsager AKI efter hjertestop. Dyremodeller af iskæmi-reperfusionsinduceret AKI (IR-AKI) af begge nyrer er sammenlignelige med patienter med AKI efter ROSC i kliniske omgivelser. IR-AKI af begge nyrer er dog teknisk udfordrende at analysere, fordi modellen er forbundet med høj dødelighed og stor variation i nyreskade, hvilket kan påvirke analysen. Letvægtsmus blev valgt, placeret under generel anæstesi med isofluran, udsat for kirurgi med en dorsolateral tilgang, og deres kropstemperatur opretholdes under drift, hvorved vævsskade reduceres og etablering af en reproducerbar akut renal IR-AKI forskningsprotokol.
Introduction
Hjertestop forekommer mere end 80.000 gange årligt i USA 1,2. Dødeligheden ved hjertestop er ekstremt høj 3,4,5,6. AKI er en væsentlig risikofaktor forbundet med høj dødelighed og dårlige neurologiske resultater hos patienter med hjertestop efter ROSC 7,8,9,10,11,12,13. Genopretning fra AKI er en god forudsigelse for gunstige neurologiske resultater og udskrivning fra hospitalet14,15,16. Imidlertid mangler effektive terapier til IR-AKI stadig 15,16,17,18,19. Yderligere terapeutiske strategier er nødvendige for yderligere at forbedre de kliniske resultater af sygdommen.
IR-AKI med bilateral renal iskæmi tilgang er en af de dyremodeller, der anvendes til AKI forskning 20,21,22,23,24,25,26. Renal IR-AKI dyremodeller er mindre komplicerede end en helkrops IR-skademodel til undersøgelse af AKI hos patienter med pludseligt hjertestop efter ROSC 6,27,28,29,30. Dette indebærer, at konsistente resultater fra en renal IR-AKI dyremodel er lettere at opnå på grund af tilstedeværelsen af færre forstyrrende faktorer i forsøg. Desuden involverer renal IR-AKI protokoller almindeligvis en ensidig eller bilateral renal pedikelokklusion. Betingelser i forsøg med bilateral renal IR-AKI er sammenlignelige med kliniske tilstande for AKI efter ROSC hos patienter med pludseligt hjertestop efter vellykket hjerte-lungeredning. Selvom nyrernes patologiske egenskaber i begge modeller afspejler de patologiske egenskaber ved human renal IR-skade 31,32,33, er en bilateral renal iskæmi-tilgang mere relevant for AKI under humane patologiske tilstande, såsom hjertesvigt, vasokonstriktion og septisk shock 35. Bilaterale renale IR-AKI dyremodeller er egnede til studier med fokus på nyre-IR-skader ved hjertestop efter ROSC.
Bilaterale renal IR-AKI modeller er forbundet med tekniske vanskeligheder, eksperimentel kompleksitet og lang kirurgisk varighed 23,26,32,33,35,36. For at overvinde disse tekniske vanskeligheder etablerede denne undersøgelse en pålidelig bilateral IR-AKI forskningsprotokol i mus ved at foretage nogle tekniske ændringer. Den foreslåede protokol resulterede i færre kirurgiske komplikationer, mindre vævsskade og en lavere sandsynlighed for dødelighed under operationen. Derfor kan det bruges til at undersøge de patofysiologiske processer i AKI efter ROSC for at udvikle nye terapeutiske strategier mod renal hypoperfusion og reperfusionsskade37,38,39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med vejledningen til pleje og brug af forsøgsdyr, udgivet af US National Institutes of Health (NIH-publikation nr. 85-23, revideret 1996). Undersøgelsesprotokollen blev godkendt af og i overensstemmelse med retningslinjerne fra Institutional Animal Care and Use Committee ved Fu-Jen Catholic University. Se materialefortegnelsen for detaljer om alle materialer og instrumenter, der anvendes i denne protokol.
1. Klargøring af musene
- Vælg 8 uger gamle C57BL/6 hanmus med en vægt på 21-23 g.
- Opstald og vedligehold musene under en 12 timers lys og mørk cyklus ved en kontrolleret temperatur (21 ± 2 °C) med fri adgang til mad, standard musefoderpiller og postevand.
2. Anæstesi
- Tag en kirurgisk maske og sterile handsker på.
- Sæt musene under bedøvelse med 2% isofluran blandet med ilt ved 1 l / min i induktionskammeret.
- Vurder anæstesiniveauet ved hjælp af pedalrefleks.
BEMÆRK: Pedalrefleks er en tilbagetrækning af bagpoten som reaktion på en fast tåklemme. Bedøvelsen er afsluttet, når pedalrefleksen forsvinder. - Flyt og placer hver mus i udsat position på en kirurgisk platform med et elektrisk tæppe for at opretholde deres kropstemperatur, når bedøvelsen er afsluttet. Stabiliser kropstemperaturen før operationen og overvåg med rektal temperatur sonder. Påfør oftalmisk salve på begge øjne for at forhindre tørhed.
- Tape musenes poter til brættet.
- Fastgør en maske til musenes overflade for at give en konstant forsyning af 1% isofluran og 1 l / min ilt
- Vurder anæstesiniveauet ved pedalrefleks regelmæssigt, og juster bedøvelsesleveringen i overensstemmelse hermed under operationen.
3. Bilateral renal IR-AKI kirurgi
- Berør ryggen og find musens lændehvirvelsøjle manuelt. Bevæg dig langs rygsøjlen cephalisk og kig efter costovertebrale vinkler, der er under begge sider af musens sidste ribben.
- Påfør hårfjerningslotion på begge sider af costovertebralvinkelområdet i ca. 30 s, og fjern derefter pelsen med saltvand.
- Desinficer den barberede hud med tre runder betadinopløsning og 75% alkohol ved hjælp af bomuldskugler.
BEMÆRK: Opretholdelse af et sterilt felt til kirurgi under hele proceduren er nøglen. Påfør en kirurgisk drapering og brug sterile instrumenter. - Brug finspidstang til forsigtigt at løfte huden under venstre costovertebral vinkel, og brug derefter en saks til at skabe et 1 cm skråt dorsolateral snit langs hudspændingslinjerne fra lændehvirvelsøjlen på venstre flanke. Transekter muskelvæggen i venstre flanke ved hjælp af en saks for at visualisere venstre nyre.
- Gentag de førnævnte kirurgiske procedurer for at visualisere den rigtige nyre. Fjern de små mængder blod, der produceres under proceduren med sterile vatpinde.
- Skub og adskil den venstre nyre forsigtigt fra det omgivende væv med tang. Identificer nyrepediklen, efter at venstre nyre er udsat.
BEMÆRK: Pas på ikke at skade binyrerne og de omgivende blodkar. - Klem over venstre nyrepedikel med et mikrovaskulært klip i 25 min. Bekræft iskæmi ved en synlig ændring i nyrefarve fra lyserød til mørk rød.
- Dæk den fastspændte nyre med sterile saltvandsvåde bomuldskugler for at undgå udtørring under venstre renal pedikelfastspænding.
- Gentag de førnævnte kirurgiske procedurer for at klemme højre nyrepedikel med et mikrovaskulært klip i 25 minutter.
- Dæk den fastspændte nyre med sterile saltvandsvåde bomuldskugler for at undgå udtørring under højre renal pedikelfastspænding.
- Overvåg anæstesidybde og fugtighed af de sterile saltvandsvåde bomuldskugler med jævne mellemrum.
- Åbn det venstre mikrovaskulære klip for at starte reperfusion af venstre nyre. Bekræft reperfusion ved en synlig farveændring af venstre nyre fra mørkerød til lyserød.
- Åbn det højre mikrovaskulære klip for at starte reperfusion af højre nyre.
- Når nyrefarveændringen er verificeret, skal du returnere nyren til bukhulen.
- Luk bughulen og huden med 6-0 absorberbare suturmaterialer.
- Skrub for at desinficere såret med en betadinopløsning og 75% alkohol ved hjælp af bomuldskugler.
- Overhold dyret omhyggeligt, indtil det begynder at bevæge sig frit og fodre.
BEMÆRK: Vær meget opmærksom på dyrene, indtil de har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystliggende. - Administrer carprofen (5 mg/kg i 0,2 ml, administreret subkutant) i 2-3 dage for at forhindre postkirurgiske smerter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvaliteten af den bilaterale renale IR-AKI kirurgi bør vurderes før yderligere mikroskopisk eller molekylær analyse. Under operationen bør nyreiskæmi bekræftes ved at se, om nyrerne har ændret farve fra lyserød til mørkerød kort efter, at nyrepediklen er fastspændt med et mikrovaskulært klip (figur 1). Efter operationen kan nyreskader forårsaget af IR-AKI kirurgi valideres yderligere med et par mikroliter serum gennem submandibulær blodindsamling til biokemisk analyse, hvor resultaterne indikerer en stigning i niveauet af blodurinstofkvælstof og kreatinin fra baseline (figur 2).
Figur 1: Renal iskæmi efter renal pedikel clamping. En nyrefarve ændres fra lyserød til mørkerød, hvilket afslører, at nyreperfusionen er blevet utilstrækkelig. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Nyreinsufficiens efter bilateral IR-AKI operation. Serumniveauer af urinstof, nitrogen og kreatinin i blodet steg 2 dage efter renal reperfusion. Forkortelser: IR-AKI = iskæmi-reperfusionsinduceret akut nyreskade; BUN = urinstofkvælstof i blodet; I / R = iskæmi-reperfusion (n = 4, *p < 0,05 versus kontrol). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den foreslåede bilaterale IR-AKI-protokol er egnet til undersøgelse af mekanismen for hypoperfusion og reperfusionsskade i begge nyrer. Protokollen antyder, at lette mus, generel anæstesi med isofluran, en dorsolateral tilgang til operationen og vedligeholdelse af kropstemperatur under operationen mindsker de tilknyttede tekniske vanskeligheder, forkorter operationens varighed og øger konsistensen af proceduren for akut bilateral renal IR-AKI forskning.
Tekniske vanskeligheder påvirker sværhedsgraden af nyreskader ved bilateral renal IR-AKI kirurgi33. Ud over musebelastning, køn, alder og varmesystemer 36,40,41,42,43,44 er korrekt placering af vaskulær klemme afgørende for ensartede resultater. Undersøgelser har anbefalet omhyggelig dissektion af det omgivende fedtvæv for at frigive nyre- og nyrepedikler eller arterier 23,26,32,35,36. Sammenlignet med mus i alderen 8-20 uger gamle, der typisk vejer 25-28 g, der er blevet undersøgt i litteraturen 23,32,35,36, brugte denne undersøgelse relativt unge og lette mus (8 uger gamle og vejer 21-23 g) for at reducere mængden af perirenal fedtvæv, som let kunne udsætte nyre- og nyrepediklerne uden at kræve perifer vævsdissektion og korrekt placering af vaskulære klemmer. Dette ville reducere procedurerelateret traume og den tekniske kompleksitet, forkorte anæstesi og kirurgiens varighed, fremskynde læringskurven for dem, der ikke er bekendt med undersøgelsesproceduren, og øge undersøgelsens reproducerbarhed.
Generel anæstesi påvirker resultaterne af en IR-AKI undersøgelse. Langvarig anæstesi øger dyretab under operationen33. I litteraturen er phenobarbitalnatrium, et langtidsvirkende barbiturat, der undertrykker centralnervesystemet, blevet administreret subkutant til IR-AKI kirurgi 26,33,35. Phenobarbital sætter ind efter 5 minutter og hjælper med at opnå kirurgisk anæstesi i mindst 15 min45. Derfor bør phenobarbital kun leveres af dygtige kirurger for at undgå forlænget anæstesi (>60 mg / kg) og tab af dyr under operation33. I modsætning hertil inducerede denne undersøgelses anvendelse af isofluran, som er et ikke-brændbart inhaleret bedøvelsesmiddel, en hurtig indtræden, der opnåede kirurgisk anæstesi på 7-10 minutter og ophørte med effekten i 15 minutter efter at have stoppet inhalationen46. Levering af isofluran sammen med ilt er let for operatøren at starte, vedligeholde og stoppe øjeblikkeligt under operationen og anbefales til renal IR-AKI kirurgi.
Endelig kan metoden til at nærme sig nyrepediklerne påvirke kvaliteten af IR-AKI kirurgi. Nogle IR-AKI undersøgelser har undersøgt renal pedicle ved hjælp af midline laparotomi, hvor bughulen blev åbnet, og bughinden og tarmene blev skubbet til side for at få adgang til nyrerne. Dette kan dog øge væske- og varmetab, kirurgirelateret traume og kirurgisk varighed32,35. Derfor foreslår denne protokol en dorsolateral tilgang til IR-AKI-forskning for at udsætte nyrerne fra flanken og retroperitoneum for at opretholde kropstemperaturen og minimere operationsrelateret skade og efterfølgende forbedre den kirurgiske tilstand og undersøgelseskonsistens.
Denne model har en potentiel anvendelse i undersøgelser, der sigter mod at identificere og karakterisere markører for bilateral nyreskade forårsaget af hjertestop efter ROSC. Imidlertid kan cytokiner, der frigives på grund af kirurgisk skade under proceduren, påvirke undersøgelsesresultaterne, hvilket gør dem urelaterede til det kliniske scenarie og begrænser oversættelsen af undersøgelsesresultaterne fra bænk til sengekant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt med hensyn til offentliggørelsen af denne artikel.
Acknowledgments
Denne model blev udviklet med økonomisk støtte fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Taiwan (MOST 109-2320-B-030-006-MY3). Dette manuskript blev redigeret af Wallace Academic Editing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbable Suture, 6-0 | Ethicon | J510G-BX | |
| Betadine solution | Shineteh Istrument | ||
| Carprofen | Sigma | PHR1452 | |
| Cotton balls | Shineteh Istrument | ||
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Heating pad | Shineteh Istrument | ||
| Isoflurane | Piramal Critical Care Inc. | 26675-46-7 | |
| Moria Vessel Clamp | Fine Science Tools | 18320-11 | |
| Olsen-Hegar needle holder | Fine Science Tools | 12002 - 12 | |
| Saline | Shineteh Istrument | ||
| Scalpel blades | Shinva | s2646 | |
| Small Animal Anesthesia Machine | Sheng-Cing Instruments Co. | STEP AS-01 | |
| Tissue scissors | Fine Science Tools | 14072 - 10 |
References
- Holmberg, M. J., et al. Annual incidence of adult and pediatric in-hospital cardiac arrest in the United States. Circulation: Cardiovascular Quality and Outcomes. 12 (7), 005580 (2019).
- Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2018 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 137 (12), 67 (2018).
- Lascarrou, J. B., et al. Targeted temperature management for cardiac arrest with nonshockable rhythm. The New England Journal of Medicine. 381 (24), 2327-2337 (2019).
- Chang, H. C., et al. Factors affecting outcomes in patients with cardiac arrest who receive target temperature management: The multi-center TIMECARD registry. Journal of the Formosan Medical Association. 121 (1), 294-303 (2022).
- Yu, G., et al. Comparison of the survival and neurological outcomes in OHCA based on smoking status: investigation of the existence of the smoker's paradox. Signa Vitae. 18 (2), 121-129 (2022).
- Chen, Y. C., et al. Major interventions are associated with survival of out of hospital cardiac arrest patients - a population based survey. Signa Vitae. 13 (2), 108-115 (2017).
- Sandroni, C., et al. Acute kidney injury after cardiac arrest: a systematic review and meta-analysis of clinical studies. Minerva Anestesiologica. 82 (9), 989-999 (2016).
- Patyna, S., et al. Acute kidney injury after in-hospital cardiac arrest in a predominant internal medicine and cardiology patient population: incidence, risk factors, and impact on survival. Renal Failure. 43 (1), 1163-1169 (2021).
- Storm, C., et al. Impact of acute kidney injury on neurological outcome and long-term survival after cardiac arrest - A 10 year observational follow up. Journal of Critical Care. 47, 254-259 (2018).
- Geri, G., et al. Acute kidney injury after out-of-hospital cardiac arrest: risk factors and prognosis in a large cohort. Intensive Care Medicine. 41 (7), 1273-1280 (2015).
- Guo, Q. Y., Xu, J., Shi, Q. D. Gasping as a predictor of short- and long-term outcomes in patients with cardiac arrest: a systematic review and meta-analysis. Signa Vitae. 17 (2), 208-213 (2021).
- Chen, P. C., et al. Prognostic factors for adults with cardiac arrest in the emergency department: a retrospective cohort study. Signa Vitae. 18 (3), 56-64 (2022).
- Lee, M. J., et al. Predictors of survival and good neurological outcomes after in-hospital cardiac arrest. Signa Vitae. 17 (2), 67-76 (2021).
- Deakin, C. D., et al. European Resuscitation Council guidelines for resuscitation 2010 section 4. adult advanced life support. Resuscitation. 81 (10), 1305-1352 (2010).
- Cha, K. C., et al. Recovery from acute kidney injury is an independent predictor of survival at 30 days only after out-of-hospital cardiac arrest who were treated by targeted temperature management. Signa Vitae. 17 (2), 119-126 (2021).
- Park, Y. S., et al. Recovery from acute kidney injury as a potent predictor of survival and good neurological outcome at discharge after out-of-hospital cardiac arrest. Critical Care. 23 (1), 256 (2019).
- Mah, K. E., et al. Acute kidney injury after in-hospital cardiac arrest. Resuscitation. 160, 49-58 (2021).
- Pelkey, T. J., et al. Minimal physiologic temperature variations during renal ischemia alter functional and morphologic outcome. Journal of Vascular Surgery. 15 (4), 619-625 (1992).
- Kim, H., et al. Effect of different combinations of initial body temperature and target temperature on neurological outcomes in out-of-hospital cardiac arrest patients treated with targeted temperature management. Signa Vitae. , 1-7 (2022).
- Wyss, J. C., et al. Differential effects of the mitochondria-active tetrapeptide SS-31 (D-Arg-dimethylTyr-Lys-Phe-NH2) and its peptidase-targeted prodrugs in experimental acute kidney injury. Frontiers in Pharmacology. 10, 1209 (2019).
- Wang, Y., Wang, B., Qi, X., Zhang, X., Ren, K. Resveratrol protects against post-contrast acute kidney injury in rabbits with diabetic nephropathy. Frontiers in Pharmacology. 10, 833 (2019).
- Li, S., Yu, L., He, A., Liu, Q. Klotho inhibits unilateral ureteral obstruction-induced endothelial-to-mesenchymal transition via TGF-beta1/Smad2/Snail1 signaling in mice. Frontiers in Pharmacology. 10, 348 (2019).
- Godoy, J. R., Watson, G., Raspante, C., Illanes, O. An effective mouse model of unilateral renal ischemia-reperfusion injury. Journal of Visualized Experiments. (173), e62749 (2021).
- Chen, Q., et al. SIRT1 mediates effects of FGF21 to ameliorate cisplatin-induced acute kidney injury. Frontiers in Pharmacology. 11, 241 (2020).
- Li, H. D., et al. Application of herbal traditional Chinese medicine in the treatment of acute kidney injury. Frontiers in Pharmacology. 10, 376 (2019).
- Grenz, A., et al. Use of a hanging-weight system for isolated renal artery occlusion during ischemic preconditioning in mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292, 475-485 (2007).
- Gao, Q., et al. Accumulated epinephrine dose is associated with acute kidney injury following resuscitation in adult cardiac arrest patients. Frontiers in Pharmacology. 13, 806592 (2022).
- Oh, Y. T., et al. Vasoactive-inotropic score as a predictor of in-hospital mortality in out-of-hospital cardiac arrest. Signa Vitae. 15 (2), 40-44 (2019).
- Burne-Taney, M. J., et al. Acute renal failure after whole body ischemia is characterized by inflammation and T cell-mediated injury. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 285 (1), 87-94 (2003).
- Adams, J. A., et al. Periodic acceleration (pGz) prior to whole body ischemia reperfusion injury provides early cardioprotective preconditioning. Life Sciences. 86 (19-20), 707-715 (2010).
- Gaut, J. P., Liapis, H. Acute kidney injury pathology and pathophysiology: a retrospective review. Clinical Kidney Journal. 14 (2), 526-536 (2021).
- Hesketh, E. E., et al. Renal ischaemia reperfusion injury: a mouse model of injury and regeneration. Journal of Visualized Experiments. (88), e51816 (2014).
- Wei, Q., Dong, Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (11), 1487-1494 (2012).
- Wei, Q., Dong, Z. Regulation and pathological role of bid in ischemic acute kidney injury. Renal Failure. 29 (8), 935-940 (2007).
- Grenz, A., et al. Use of a hanging-weight system for isolated renal artery occlusion. Journal of Visualized Experiments. (53), e2549 (2011).
- Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. Journal of Visualized Experiments. (78), e50495 (2013).
- Han, S. J., Lee, H. T. Mechanisms and therapeutic targets of ischemic acute kidney injury. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (4), 427-440 (2019).
- Huang, C. W., et al. A novel caffeic acid derivative prevents renal remodeling after ischemia/reperfusion injury. Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112028 (2021).
- Spoelstra-de Man, A. M. E., Oudemans-van Straaten, H. M. Acute kidney injury after cardiac arrest: the role of coronary angiography and temperature management. Critical Care. 23 (1), 193 (2019).
- Burne, M. J., Haq, M., Matsuse, H., Mohapatra, S., Rabb, H. Genetic susceptibility to renal ischemia reperfusion injury revealed in a murine model. Transplantation. 69 (5), 1023-1025 (2000).
- Muller, V., et al. Sexual dimorphism in renal ischemia-reperfusion injury in rats: possible role of endothelin. Kidney International. 62 (4), 1364-1371 (2002).
- Schmitt, R., Marlier, A., Cantley, L. G. Zag expression during aging suppresses proliferation after kidney injury. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (12), 2375-2383 (2008).
- Oxburgh, L., de Caestecker, M. P.
- Delbridge, M. S., Shrestha, B. M., Raftery, A. T., El Nahas, A. M., Haylor, J. L. The effect of body temperature in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation Proceedings. 39 (10), 2983-2985 (2007).
- IBM Micromedx, I. Phenobarbital sodium. IBM Corporation. , Available from: https://www-micromedexsolutions-com.autorpa.mmh.org.tw/micromedex2/librarian/CS/53C834/ND_PR/evidencexpert/ND_P/evidencexpert/DUPLICATIONSHIELDSYNC/51EFF0/ND_PG/evidencexpert/ND_B/evidencexpert/ND_AppProduct/evidencexpert/ND_T/evidencexpert/PFActionId/evidencexpert.DoIntegratedSearch?SearchTerm=Phenobarbital+Sodium&fromInterSaltBase=true&UserMdxSearchTerm=%24userMdxSearchTerm&false=null&=null# (2022).
- IBM Micromedx, Isoflurane. IBM Corporation. , Available from: https://www-micromedexsolutions-com.autorpa.mmh.org.tw/micromedex2/librarian/PFDefaultActionId/evidencexpert.DoIntegratedSearch?navitem=headerLogout# (2022).
