Summary
Denna studie etablerade ett protokoll med fokus på teknisk förfining av en musmodell av bilateral renal ischemi-reperfusion för forskning om akut njurskada.
Abstract
Hjärtstopp utgör en stor börda för folkhälsan. Akut njurskada (AKI) är en negativ markör hos överlevare av hjärtstopp efter återkomst av spontan cirkulation (ROSC) efter framgångsrik hjärt-lungräddning. Omvänt är återhämtning av njurfunktionen från AKI en prediktor för gynnsamma neurologiska resultat och utskrivning från sjukhus. Det saknas dock en effektiv intervention för att förhindra njurskador orsakade av hjärtstopp efter ROSC, vilket tyder på att ytterligare terapeutiska strategier krävs. Njurhypoperfusion och reperfusion är två patofysiologiska mekanismer som orsakar AKI efter hjärtstopp. Djurmodeller av ischemi-reperfusionsinducerad AKI (IR-AKI) i båda njurarna är jämförbara med patienter med AKI efter ROSC i klinisk miljö. IR-AKI för båda njurarna är dock tekniskt utmanande att analysera eftersom modellen är förknippad med hög dödlighet och stor variation i njurskador, vilket kan påverka analysen. Lätta möss valdes ut, placerades under narkos med isofluran, utsattes för kirurgi med dorsolateralt tillvägagångssätt och deras kroppstemperatur bibehölls under operationen, vilket minskade vävnadsskador och etablerade ett reproducerbart akut renalt IR-AKI-forskningsprotokoll.
Introduction
Hjärtstopp inträffar mer än 80 000 gånger årligen i USA 1,2. Dödligheten vid hjärtstopp är extremt hög 3,4,5,6. AKI är en viktig riskfaktor förknippad med hög dödlighet och dåliga neurologiska utfall hos patienter med hjärtstillestånd efter ROSC 7,8,9,10,11,12,13. Återhämtning från AKI är en bra prediktor för gynnsamma neurologiska resultat och utskrivning från sjukhuset14,15,16. Effektiva terapier för IR-AKI saknas dock fortfarande 15,16,17,18,19. Ytterligare terapeutiska strategier krävs för att ytterligare förbättra de kliniska resultaten av sjukdomen.
IR-AKI med bilateral njurischemimetod är en av de djurmodeller som används för AKI-forskning 20,21,22,23,24,25,26. Renala IR-AKI-djurmodeller är mindre komplicerade än en helkroppsmodell för IR-skada för studier av AKI hos patienter med plötsligt hjärtstopp efter ROSC 6,27,28,29,30. Detta innebär att konsekventa resultat från en renal IR-AKI-djurmodell är lättare att uppnå på grund av förekomsten av färre störfaktorer i experiment. Dessutom involverar renala IR-AKI-protokoll vanligtvis en ensidig eller bilateral njurpedikelocklusion. Förhållandena i experiment på bilateral renal IR-AKI är jämförbara med kliniska förhållanden för AKI efter ROSC hos patienter med plötsligt hjärtstopp efter framgångsrik hjärt-lungräddning. Även om njurarnas patologiska egenskaper i båda modellerna återspeglar de patologiska egenskaperna hos human njurskada 31,32,33, är en bilateral njurischemimetod mer relevant för AKI under humana patologiska tillstånd, såsom hjärtsvikt, vasokonstriktion och septisk chock 35. Bilaterala renala IR-AKI-djurmodeller är lämpliga för studier med fokus på renala IR-skador vid hjärtstopp efter ROSC.
Bilaterala renala IR-AKI-modeller är förknippade med tekniska svårigheter, experimentell komplexitet och lång operationstid 23,26,32,33,35,36. För att övervinna dessa tekniska svårigheter etablerade den aktuella studien ett tillförlitligt bilateralt IR-AKI-forskningsprotokoll i möss genom att göra vissa tekniska modifieringar. Det föreslagna protokollet resulterade i färre kirurgiska komplikationer, mindre vävnadsskador och en lägre sannolikhet för dödlighet under operationen. Därför kan den användas för att undersöka de patofysiologiska processerna för AKI efter ROSC för att utveckla nya terapeutiska strategier mot njurhypoperfusion och reperfusionsskada37,38,39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, utgiven av US National Institutes of Health (NIH publikation nr 85-23, reviderad 1996). Studieprotokollet godkändes av och i enlighet med riktlinjerna från Institutional Animal Care and Use Committee vid Fu-Jen Catholic University. Se materialtabellen för detaljer om alla material och instrument som används i detta protokoll.
1. Förbereda mössen
- Välj 8 veckor gamla C57BL/6 hanmöss med en vikt på 21-23 g.
- Inhyss och underhåll mössen under en 12 timmars ljus- och mörkercykel vid en kontrollerad temperatur (21 ± 2 °C) med fri tillgång till mat, vanliga musfoderpellets och kranvatten.
2. Anestesi
- Ta på dig ett kirurgiskt munskydd och sterila handskar.
- Sövs mössen med 2 % isofluran blandat med syrgas vid 1 l/min i induktionskammaren.
- Bedöm nivån av anestesi med pedalreflex.
OBS: Pedalreflex är en indragning av baktassen som svar på ett fast tånyp. Bedövningen är klar när pedalreflexen försvinner. - Flytta och placera varje mus i bukläge på en operationsplattform med en elektrisk filt för att bibehålla kroppstemperaturen när bedövningen är klar. Stabilisera kroppstemperaturen före operationen och övervaka med rektala temperatursonder. Applicera ögonsalva i båda ögonen för att förhindra torrhet.
- Tejpa fast mössens tassar på brädan.
- Fäst en mask på mössens ansikte för att ge en konstant tillförsel av 1 % isofluran och 1 L/min syre
- Bedöm anestesinivån med pedalreflex regelbundet och justera anestesitillförseln därefter under operationen.
3. Bilateral njurkirurgi IR-AKI
- Rör vid baksidan och hitta mössens ländrygg manuellt. Rör dig längs ryggraden cefaliskt och leta efter costovertebrala vinklar som ligger under båda sidor av mössens sista revben.
- Applicera hårborttagningslotion på båda sidor av costovertebral vinkelområdet i cirka 30 s och ta sedan bort pälsen med koksaltlösning.
- Desinficera den rakade huden med tre omgångar betadinlösning och 75 % alkohol med hjälp av bomullstussar.
OBS: Det är viktigt att upprätthålla ett sterilt fält för operation under hela proceduren. Applicera ett kirurgiskt draperi och använd sterila instrument. - Använd en pincett med fin spets för att försiktigt lyfta huden under den vänstra costovertebrala vinkeln, och använd sedan en sax för att skapa ett 1 cm snett dorsolateralt snitt längs hudspänningslinjerna från ländryggens mittlinje på vänster flank. Transektera muskelväggen på vänster flank med en sax för att visualisera den vänstra njuren.
- Upprepa de ovan nämnda kirurgiska ingreppen för att visualisera den högra njuren. Ta bort de små mängder blod som produceras under proceduren med sterila bomullspinnar.
- Tryck och separera den vänstra njuren försiktigt från den omgivande vävnaden med en pincett. Identifiera njurpedikeln efter att den vänstra njuren har exponerats.
OBS: Var försiktig så att du inte skadar binjuren och de omgivande blodkärlen. - Kläm över vänster njurpedikel med en mikrovaskulär klämma i 25 min. Bekräfta ischemi genom en synlig förändring av njurfärgen från rosa till mörkröd.
- Täck den fastspända njuren med sterila våta bomullstussar med koksaltlösning för att undvika uttorkning vid avnavling av vänster njurpedikel.
- Upprepa de ovan nämnda kirurgiska ingreppen för att klämma fast höger njurpedikel med en mikrovaskulär klämma i 25 minuter.
- Täck den fastspända njuren med sterila våta bomullstussar med koksaltlösning för att undvika uttorkning vid avnavling av höger njurpedikel.
- Övervaka anestesidjupet och fuktigheten hos de sterila våta bomullstussarna med koksaltlösning med jämna mellanrum.
- Öppna den vänstra mikrovaskulära klämman för att starta reperfusion av vänster njure. Bekräfta reperfusionen genom en synlig färgförändring av vänster njure från mörkröd till rosa.
- Öppna den högra mikrovaskulära klämman för att starta reperfusion av höger njure.
- Efter att njurfärgsförändringen har verifierats, återför njuren till bukhålan.
- Stäng bukhålan och huden med 6-0 absorberbara suturmaterial.
- Skrubba för att desinficera såret med en betadinlösning och 75 % alkohol med hjälp av bomullstussar.
- Observera djuret noga tills det börjar röra sig fritt och äta.
OBS: Var uppmärksam på djuren tills de har återfått tillräckligt med medvetande för att bibehålla sternal liggande. - Administrera karprofen (5 mg/kg i 0,2 ml, administrerat subkutant) i 2-3 dagar för att förhindra postoperativ smärta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvaliteten på den bilaterala renala IR-AKI-operationen bör bedömas före ytterligare mikroskopisk eller molekylär analys. Under operationen bör njurischemi bekräftas genom att se om njuren har ändrat färg från rosa till mörkröd strax efter att njurpedikeln klämts fast med en mikrovaskulär klämma (Figur 1). Efter operationen kan njurskador orsakade av IR-AKI-kirurgi valideras ytterligare med några mikroliter serum genom submandibulär blodinsamling för biokemisk analys där resultaten indikerar en ökning av nivån av ureakväve och kreatinin i blodet från baslinjen (Figur 2).
Figur 1: Renal ischemi efter avnavling av njurpedikel. En njurfärgsförändring från rosa till mörkröd avslöjar att njurperfusionen har blivit otillräcklig. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Njurinsufficiens efter bilateral IR-AKI-kirurgi. Serumnivåerna av ureakväve och kreatinin i blodet ökade 2 dagar efter renal reperfusion. Förkortningar: IR-AKI = ischemi-reperfusion-inducerad akut njurskada; BUN = blodureakväve; I/R = ischemi-reperfusion (n = 4, *p < 0,05 jämfört med kontroll). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det föreslagna bilaterala IR-AKI-protokollet är lämpligt för att undersöka mekanismen för hypoperfusion och reperfusionsskada i båda njurarna. Protokollet föreslår att lätta möss, generell anestesi med isofluran, ett dorsolateralt tillvägagångssätt för operationen och upprätthållande av kroppstemperatur under operationen mildrar de associerade tekniska svårigheterna, förkortar operationens varaktighet och ökar enhetligheten i proceduren för akut bilateral renal IR-AKI-forskning.
Tekniska svårigheter påverkar njurskadornas svårighetsgrad vid bilateral renal IR-AKI-kirurgi33. Förutom musstam, kön, ålder och värmesystem 36,40,41,42,43,44 är korrekt placering av kärlklämman avgörande för konsekventa resultat. Studier har rekommenderat noggrann dissektion av den omgivande fettvävnaden för att frigöra njur- och njurpediklar eller artärer 23,26,32,35,36. Jämfört med möss i åldern 8-20 veckor som vanligtvis väger 25-28 g som har studerats i litteraturen 23,32,35,36, använde denna studie relativt unga och lätta möss (8 veckor gamla och vägande 21-23 g) för att minska mängden perirenal fettvävnad, vilket lätt kunde exponera njur- och njurpediklarna utan att kräva perifer vävnadsdissektion och korrekt placering av kärlklämmorna. Detta skulle minska procedurrelaterat trauma och den tekniska komplexiteten, förkorta anestesi- och operationstiden, påskynda inlärningskurvan för dem som inte är bekanta med studieproceduren och öka studiens reproducerbarhet.
Generell anestesi påverkar resultaten av en IR-AKI-studie. Långvarig anestesi ökar djurförlusten under operation33. I litteraturen har fenobarbitalnatrium, ett långverkande barbiturat som trycker ner det centrala nervsystemet, administrerats subkutant för IR-AKI-kirurgi 26,33,35. Fenobarbital sätter in efter 5 minuter och hjälper till att uppnå kirurgisk anestesi på minst 15 minuter45. Därför ska fenobarbital endast administreras av skickliga kirurger för att undvika förlängd anestesi (>60 mg/kg) och djurförlust under operation33. Däremot inducerade denna studies användning av isofluran, som är ett icke brandfarligt inhalationsbedövningsmedel, en snabb debut som uppnådde kirurgisk anestesi på 7-10 minuter och upphörde effekten på 15 minuter efter att inhalationen avslutats46. Tillförseln av isofluran, i kombination med syrgas, är lätt för operatören att starta, underhålla och stoppa omedelbart under operationen och rekommenderas för renal IR-AKI-kirurgi.
Slutligen kan metoden för att närma sig njurpediklarna påverka kvaliteten på IR-AKI-kirurgi. Vissa IR-AKI-studier har undersökt njurpedikel med hjälp av laparotomi i mitten av linjen där bukhålan öppnades och bukhinnan och tarmarna trycktes åt sidan för att komma åt njuren. Att göra det kan dock öka vätske- och värmeförlusten, kirurgirelaterat trauma och kirurgisk varaktighet32,35. Därför föreslår detta protokoll ett dorsolateralt tillvägagångssätt för IR-AKI-forskning för att exponera njuren från flanken och retroperitoneum för att bibehålla kroppstemperaturen och för att minimera kirurgiska skador, vilket därefter förbättrar det kirurgiska tillståndet och studiekonsistensen.
Denna modell har en potentiell tillämpning i studier som syftar till att identifiera och karakterisera markörer för bilateral njurskada orsakad av hjärtstopp efter ROSC. Cytokiner som frigörs på grund av kirurgisk skada under ingreppet kan dock påverka studieresultaten, vilket gör dem omöjliga att relatera till det kliniska scenariot och begränsar översättningen av studieresultaten från bänksidan till sängkanten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte föreligger någon intressekonflikt när det gäller publiceringen av denna artikel.
Acknowledgments
Denna modell har utvecklats med ekonomiskt stöd från Taiwans ministerium för vetenskap och teknik (MOST 109-2320-B-030-006-MY3). Detta manuskript redigerades av Wallace Academic Editing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbable Suture, 6-0 | Ethicon | J510G-BX | |
| Betadine solution | Shineteh Istrument | ||
| Carprofen | Sigma | PHR1452 | |
| Cotton balls | Shineteh Istrument | ||
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Heating pad | Shineteh Istrument | ||
| Isoflurane | Piramal Critical Care Inc. | 26675-46-7 | |
| Moria Vessel Clamp | Fine Science Tools | 18320-11 | |
| Olsen-Hegar needle holder | Fine Science Tools | 12002 - 12 | |
| Saline | Shineteh Istrument | ||
| Scalpel blades | Shinva | s2646 | |
| Small Animal Anesthesia Machine | Sheng-Cing Instruments Co. | STEP AS-01 | |
| Tissue scissors | Fine Science Tools | 14072 - 10 |
References
- Holmberg, M. J., et al. Annual incidence of adult and pediatric in-hospital cardiac arrest in the United States. Circulation: Cardiovascular Quality and Outcomes. 12 (7), 005580 (2019).
- Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2018 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 137 (12), 67 (2018).
- Lascarrou, J. B., et al. Targeted temperature management for cardiac arrest with nonshockable rhythm. The New England Journal of Medicine. 381 (24), 2327-2337 (2019).
- Chang, H. C., et al. Factors affecting outcomes in patients with cardiac arrest who receive target temperature management: The multi-center TIMECARD registry. Journal of the Formosan Medical Association. 121 (1), 294-303 (2022).
- Yu, G., et al. Comparison of the survival and neurological outcomes in OHCA based on smoking status: investigation of the existence of the smoker's paradox. Signa Vitae. 18 (2), 121-129 (2022).
- Chen, Y. C., et al. Major interventions are associated with survival of out of hospital cardiac arrest patients - a population based survey. Signa Vitae. 13 (2), 108-115 (2017).
- Sandroni, C., et al. Acute kidney injury after cardiac arrest: a systematic review and meta-analysis of clinical studies. Minerva Anestesiologica. 82 (9), 989-999 (2016).
- Patyna, S., et al. Acute kidney injury after in-hospital cardiac arrest in a predominant internal medicine and cardiology patient population: incidence, risk factors, and impact on survival. Renal Failure. 43 (1), 1163-1169 (2021).
- Storm, C., et al. Impact of acute kidney injury on neurological outcome and long-term survival after cardiac arrest - A 10 year observational follow up. Journal of Critical Care. 47, 254-259 (2018).
- Geri, G., et al. Acute kidney injury after out-of-hospital cardiac arrest: risk factors and prognosis in a large cohort. Intensive Care Medicine. 41 (7), 1273-1280 (2015).
- Guo, Q. Y., Xu, J., Shi, Q. D. Gasping as a predictor of short- and long-term outcomes in patients with cardiac arrest: a systematic review and meta-analysis. Signa Vitae. 17 (2), 208-213 (2021).
- Chen, P. C., et al. Prognostic factors for adults with cardiac arrest in the emergency department: a retrospective cohort study. Signa Vitae. 18 (3), 56-64 (2022).
- Lee, M. J., et al. Predictors of survival and good neurological outcomes after in-hospital cardiac arrest. Signa Vitae. 17 (2), 67-76 (2021).
- Deakin, C. D., et al. European Resuscitation Council guidelines for resuscitation 2010 section 4. adult advanced life support. Resuscitation. 81 (10), 1305-1352 (2010).
- Cha, K. C., et al. Recovery from acute kidney injury is an independent predictor of survival at 30 days only after out-of-hospital cardiac arrest who were treated by targeted temperature management. Signa Vitae. 17 (2), 119-126 (2021).
- Park, Y. S., et al. Recovery from acute kidney injury as a potent predictor of survival and good neurological outcome at discharge after out-of-hospital cardiac arrest. Critical Care. 23 (1), 256 (2019).
- Mah, K. E., et al. Acute kidney injury after in-hospital cardiac arrest. Resuscitation. 160, 49-58 (2021).
- Pelkey, T. J., et al. Minimal physiologic temperature variations during renal ischemia alter functional and morphologic outcome. Journal of Vascular Surgery. 15 (4), 619-625 (1992).
- Kim, H., et al. Effect of different combinations of initial body temperature and target temperature on neurological outcomes in out-of-hospital cardiac arrest patients treated with targeted temperature management. Signa Vitae. , 1-7 (2022).
- Wyss, J. C., et al. Differential effects of the mitochondria-active tetrapeptide SS-31 (D-Arg-dimethylTyr-Lys-Phe-NH2) and its peptidase-targeted prodrugs in experimental acute kidney injury. Frontiers in Pharmacology. 10, 1209 (2019).
- Wang, Y., Wang, B., Qi, X., Zhang, X., Ren, K. Resveratrol protects against post-contrast acute kidney injury in rabbits with diabetic nephropathy. Frontiers in Pharmacology. 10, 833 (2019).
- Li, S., Yu, L., He, A., Liu, Q. Klotho inhibits unilateral ureteral obstruction-induced endothelial-to-mesenchymal transition via TGF-beta1/Smad2/Snail1 signaling in mice. Frontiers in Pharmacology. 10, 348 (2019).
- Godoy, J. R., Watson, G., Raspante, C., Illanes, O. An effective mouse model of unilateral renal ischemia-reperfusion injury. Journal of Visualized Experiments. (173), e62749 (2021).
- Chen, Q., et al. SIRT1 mediates effects of FGF21 to ameliorate cisplatin-induced acute kidney injury. Frontiers in Pharmacology. 11, 241 (2020).
- Li, H. D., et al. Application of herbal traditional Chinese medicine in the treatment of acute kidney injury. Frontiers in Pharmacology. 10, 376 (2019).
- Grenz, A., et al. Use of a hanging-weight system for isolated renal artery occlusion during ischemic preconditioning in mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292, 475-485 (2007).
- Gao, Q., et al. Accumulated epinephrine dose is associated with acute kidney injury following resuscitation in adult cardiac arrest patients. Frontiers in Pharmacology. 13, 806592 (2022).
- Oh, Y. T., et al. Vasoactive-inotropic score as a predictor of in-hospital mortality in out-of-hospital cardiac arrest. Signa Vitae. 15 (2), 40-44 (2019).
- Burne-Taney, M. J., et al. Acute renal failure after whole body ischemia is characterized by inflammation and T cell-mediated injury. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 285 (1), 87-94 (2003).
- Adams, J. A., et al. Periodic acceleration (pGz) prior to whole body ischemia reperfusion injury provides early cardioprotective preconditioning. Life Sciences. 86 (19-20), 707-715 (2010).
- Gaut, J. P., Liapis, H. Acute kidney injury pathology and pathophysiology: a retrospective review. Clinical Kidney Journal. 14 (2), 526-536 (2021).
- Hesketh, E. E., et al. Renal ischaemia reperfusion injury: a mouse model of injury and regeneration. Journal of Visualized Experiments. (88), e51816 (2014).
- Wei, Q., Dong, Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (11), 1487-1494 (2012).
- Wei, Q., Dong, Z. Regulation and pathological role of bid in ischemic acute kidney injury. Renal Failure. 29 (8), 935-940 (2007).
- Grenz, A., et al. Use of a hanging-weight system for isolated renal artery occlusion. Journal of Visualized Experiments. (53), e2549 (2011).
- Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. Journal of Visualized Experiments. (78), e50495 (2013).
- Han, S. J., Lee, H. T. Mechanisms and therapeutic targets of ischemic acute kidney injury. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (4), 427-440 (2019).
- Huang, C. W., et al. A novel caffeic acid derivative prevents renal remodeling after ischemia/reperfusion injury. Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112028 (2021).
- Spoelstra-de Man, A. M. E., Oudemans-van Straaten, H. M. Acute kidney injury after cardiac arrest: the role of coronary angiography and temperature management. Critical Care. 23 (1), 193 (2019).
- Burne, M. J., Haq, M., Matsuse, H., Mohapatra, S., Rabb, H. Genetic susceptibility to renal ischemia reperfusion injury revealed in a murine model. Transplantation. 69 (5), 1023-1025 (2000).
- Muller, V., et al. Sexual dimorphism in renal ischemia-reperfusion injury in rats: possible role of endothelin. Kidney International. 62 (4), 1364-1371 (2002).
- Schmitt, R., Marlier, A., Cantley, L. G. Zag expression during aging suppresses proliferation after kidney injury. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (12), 2375-2383 (2008).
- Oxburgh, L., de Caestecker, M. P.
- Delbridge, M. S., Shrestha, B. M., Raftery, A. T., El Nahas, A. M., Haylor, J. L. The effect of body temperature in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation Proceedings. 39 (10), 2983-2985 (2007).
- IBM Micromedx, I. Phenobarbital sodium. IBM Corporation. , Available from: https://www-micromedexsolutions-com.autorpa.mmh.org.tw/micromedex2/librarian/CS/53C834/ND_PR/evidencexpert/ND_P/evidencexpert/DUPLICATIONSHIELDSYNC/51EFF0/ND_PG/evidencexpert/ND_B/evidencexpert/ND_AppProduct/evidencexpert/ND_T/evidencexpert/PFActionId/evidencexpert.DoIntegratedSearch?SearchTerm=Phenobarbital+Sodium&fromInterSaltBase=true&UserMdxSearchTerm=%24userMdxSearchTerm&false=null&=null# (2022).
- IBM Micromedx, Isoflurane. IBM Corporation. , Available from: https://www-micromedexsolutions-com.autorpa.mmh.org.tw/micromedex2/librarian/PFDefaultActionId/evidencexpert.DoIntegratedSearch?navitem=headerLogout# (2022).
