Medicine

急性腎障害研究のための両側性腎虚血再灌流マウスモデルの技術的改良

Published: November 3, 2023 doi: 10.3791/63957

Hui-Chun Ku¹, Cheng-Wei Huang¹, Shih Yi Lee^2,3

¹Department of Life Science, Fu Jen Catholic University, ²MacKay Junior College of Medicine, Nursing, and Management, ³Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Department of Internal Medicine, MacKay Memorial Hospital

Summary

この研究は、急性腎障害研究のための両側腎虚血再灌流のマウスモデルの技術的改良に焦点を当てたプロトコルを確立しました。

Abstract

心停止は公衆衛生上の大きな負担となります。急性腎障害(AKI)は、心肺蘇生が成功した後の自発循環(ROSC)の復帰後の心停止の生存者における有害マーカーです。逆に、AKIからの腎機能の回復は、良好な神経学的転帰と退院の予測因子です。しかし、ROSC後の心停止による腎障害を予防するための効果的な介入は不足しており、追加の治療戦略が必要であることが示唆されている。腎低灌流と再灌流は、心停止後にAKIを引き起こす2つの病態生理学的メカニズムです。両方の腎臓の虚血再灌流誘発AKI(IR-AKI)の動物モデルは、臨床現場でROSCに続くAKI患者に匹敵します。しかし、両腎臓のIR-AKIは、死亡率が高く、腎臓の損傷に大きなばらつきがあり、分析に影響を与える可能性があるため、解析が技術的に困難である。軽量マウスを選択し、イソフルランによる全身麻酔下に配置し、背外側アプローチで手術を行い、手術中に体温を維持することで、組織の損傷を軽減し、再現性のある急性腎IR-AKI研究プロトコルを確立しました。

Introduction

米国では年間80,000回以上、心停止が発生しています^1,2。心停止の死亡率は非常に高い^3,4,5,6です。AKIは、ROSC⁷、⁸、⁹^、^10、11、¹²^、¹³後の心停止患者における高い死亡率と神経学的転帰の不良に関連する主要な危険因子です。AKIからの回復は、良好な神経学的転帰と退院の優れた予測因子です^14,15,16。しかし、IR-AKIの効果的な治療法はまだ不足しています¹⁵、¹⁶^、¹⁷、¹⁸^、¹⁹。この疾患の臨床転帰をさらに改善するには、追加の治療戦略が必要です。

両側腎虚血アプローチによるIR-AKIは、AKI研究に使用される動物モデルの1つです²⁰、21、22、23、²⁴^、²⁵^、²⁶。腎 IR-AKI 動物モデルは、ROSC 6,27,28,29,30 後の突然の心停止患者における AKI の研究において、全身 IR 損傷モデルよりも複雑ではありません。これは、実験における交絡因子が少ないため、腎臓IR-AKI動物モデルからの一貫した結果を達成しやすいことを意味します。さらに、腎臓 IR-AKI プロトコルには、通常、片側性または両側の腎椎弓根閉塞が含まれます。両側腎IR-AKIの実験条件は、心肺蘇生が成功した後に突然心停止した患者のROSC後のAKIの臨床状態に匹敵します。両方のモデルにおける腎臓の病理学的特徴は、ヒト腎IR損傷の病理学的特徴を反映しているが31,32,33、両側性腎虚血アプローチは、心不全、血管収縮、敗血症性ショックなどのヒトの病理学的条件下でのAKIにより関連している³⁵。両側腎IR-AKI動物モデルは、ROSC後の心停止における腎IR損傷に焦点を当てた研究に適しています。

両側腎IR-AKIモデルは、技術的な困難、実験の複雑さ、および長い手術期間に関連しています23、²⁶^、³²、³³、³⁵^、³⁶。これらの技術的困難を克服するために、本研究では、いくつかの技術的修正を加えることにより、マウスにおける信頼性の高い双方向IR-AKI研究プロトコルを確立しました。提案されたプロトコルは、外科的合併症の減少、組織損傷の減少、および手術中の死亡率の低下をもたらしました。したがって、ROSC後のAKIの病態生理学的プロセスを調査して、腎低灌流および再灌流損傷に対する新しい治療戦略を開発するために使用できます37,38,39。

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Protocol

すべての動物実験は、米国国立衛生研究所が発行した実験 動物のケアと使用に関するガイド(NIH出版物番号85-23、1996年改訂)に従って実施されました。研究プロトコルは、Fu-Jen Catholic UniversityのInstitutional Animal Care and Use Committeeのガイドラインに従って承認されました。このプロトコルで使用されるすべての材料と機器の詳細については、 材料表 を参照してください。

1.マウスの準備

体重21〜23gの8週齢のC57BL/6雄マウスを選択します。
制御された温度(21〜2°C)で12時間の明暗サイクルでマウスを飼育±維持し、餌、標準的なマウスの餌ペレット、水道水を自由に利用できるようにします。

2.麻酔

サージカルマスクと滅菌手袋を着用してください。
誘導チャンバー内で、2%イソフルランと酸素を1L/minで混合した麻酔下に置きます。
ペダル反射による麻酔のレベルを評価します。
注意: ペダル反射は、つま先がしっかりとつままれたときに後ろ足を引っ込めることです。ペダル反射が消えると麻酔は完了です。
麻酔が完了したら、各マウスを電気毛布で手術台にうつ伏せの位置に移動させ、体温を維持します。手術前に体温を安定させ、直腸温度プローブで監視します。乾燥を防ぐために両目に眼軟膏を塗ります。
マウスの足をボードにテープで固定します。
マウスの顔にマスクを装着し、1%イソフルランと1L/minの酸素を一定に供給します。
ペダル反射による麻酔のレベルを定期的に評価し、手術中にそれに応じて麻酔薬の投与を調整します。

3.両側腎IR-AKI手術

背中を触って、マウスの腰椎を手動で見つけます。脊椎に沿って頭側に移動し、マウスの最後の肋骨の両側の下にある肋骨角を探します。
肋骨角部の両側に脱毛ローションを約30秒間塗布した後、生理食塩水で毛皮を取り除きます。
剃った皮膚をベタジン溶液3回と綿球を使用した75%アルコールで消毒します。
注:手術中、手術のために無菌フィールドを維持することが鍵となります。外科用ドレープを適用し、滅菌器具を使用します。
先端の細い鉗子を使用して、左肋骨角より下の皮膚を静かに持ち上げ、次にハサミを使用して、左脇腹の腰椎正中線から皮膚の緊張線に沿って1cmの斜め背外側切開を作成します。ハサミを使って左脇腹の筋肉壁を切除し、左腎臓を視覚化します。
前述の外科的処置を繰り返して、右腎臓を視覚化します。滅菌綿棒で施術中に生成された少量の血液を取り除きます。
鉗子で左腎臓を周囲の組織から慎重に押して分離します。左腎臓が露出した後の腎椎弓根を特定します。
注意: 副腎や周囲の血管を傷つけないように注意してください。
左腎椎弓根を微小血管クリップで25分間クランプします。腎臓の色がピンクから濃い赤に目に見える変化で虚血を確認します。
左腎椎弓根クランプ中の乾燥を避けるために、クランプされた腎臓を滅菌生理食塩水湿った綿球で覆います。.
前述の外科的処置を繰り返して、右腎椎弓根を微小血管クリップで25分間クランプします。
クランプされた腎臓を滅菌生理食塩水湿った綿球で覆い、右腎椎弓根クランプ中の乾燥を防ぎます。.
滅菌生理食塩水湿った綿球の麻酔の深さと湿度を定期的に監視します。
左微小血管クリップを開いて、左腎臓の再灌流を開始します。左腎臓の濃い赤からピンクへの目に見える色の変化によって再灌流を確認します。
右の微小血管クリップを開いて、右腎臓の再灌流を開始します。
腎臓の色の変化が確認されたら、腎臓を腹腔に戻します。
腹腔と皮膚を6-0の吸収性縫合糸材料で閉じます。
綿球を使用して、ベタジン溶液と75%アルコールで傷口をこすり洗いして消毒します。
動物が自由に動き始め、餌を食べ始めるまで、動物を注意深く観察します。
注:動物が胸骨臥位を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物に細心の注意を払ってください。
術後の痛みを防ぐために、カルプロフェン(0.2 mLで5 mg / kg、皮下投与)を2〜3日間投与します。

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Representative Results

両側腎IR-AKI手術の質は、さらなる顕微鏡的または分子的分析の前に評価されるべきである。手術中、腎椎弓根を微小血管クリップで固定した直後に腎臓の色がピンク色から暗赤色に変化したかどうかを確認することで、腎虚血を確認する必要があります(図1)。手術後、IR-AKI手術によって引き起こされた腎臓の損傷は、生化学的分析のために顎下採血を通じて数マイクロリットルの血清でさらに検証することができ、その結果、ベースラインからの血中尿素窒素およびクレアチニンのレベルの上昇が示されました(図2)。

図1:腎椎弓根クランプ後の腎虚血。腎臓の色がピンクから濃い赤に変化し、腎臓の灌流が不十分になったことを示しています。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:両側IR-AKI手術後の腎不全。腎再灌流の2日後に血中尿素窒素およびクレアチニンの血清濃度が上昇した。略語:IR-AKI =虚血再灌流誘発性急性腎障害;BUN =血中尿素窒素;I/R = 虚血再灌流 (n = 4、*p < 0.05 対対照)。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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Discussion

提案された両側IR-AKIプロトコルは、両方の腎臓の低灌流および再灌流損傷のメカニズムを調査するのに適しています。プロトコルは、軽量マウス、イソフルランによる全身麻酔、手術への背側アプローチ、および手術中の体温維持が、関連する技術的困難を軽減し、手術の期間を短縮し、急性両側腎IR-AKI研究の手順の一貫性を高めることを示唆しています。

技術的な困難は、両側腎IR-AKI手術における腎障害の重症度に影響を与えます³³.マウスの緊張、性別、年齢、および加熱システム³⁶、⁴⁰^、⁴¹、⁴²、⁴³、⁴⁴に加えて、一貫した結果を得るためには^、血管クランプの適切な配置が不可欠です。研究では、腎臓と腎臓の椎弓根または動脈を解放するために、周囲の脂肪組織を慎重に解剖することが推奨されています23,26,32,35,36。文献^23,32,35,36で研究されている8〜20週齢のマウスと比較して、この研究では、比較的若くて軽いマウス(8週齢で体重21〜²³ g)を使用して腎周囲脂肪組織の量を減らし、末梢組織の解剖と血管クランプの適切な配置を必要とせずに腎臓と腎臓の椎弓根を簡単に露出させることができました。これにより、手順に関連する外傷と技術的な複雑さが軽減され、麻酔と手術時間が短縮され、研究手順に慣れていない人の学習曲線が速くなり、研究の再現性が向上します。

全身麻酔はIR-AKI試験の結果に影響を与えます。麻酔が長引くと、手術中の動物の損失が増加します³³。文献では、中枢神経系を抑制する長時間作用型バルビツール酸塩であるフェノバルビタールナトリウムが、IR-AKI手術のために皮下投与されています26,33,35。フェノバルビタールは5分後に開始し、少なくとも15分で外科的麻酔を達成するのに役立ちます⁴⁵。したがって、フェノバルビタールは、麻酔の延長(>60 mg / kg)と手術中の動物の損失を避けるために、熟練した外科医によってのみ投与されるべきです³³。対照的に、この研究のイソフルランの使用は、不燃性の吸入麻酔薬であり、7〜10分で外科的麻酔を達成し、吸入を中止してから15分で効果が停止する急速な発症を誘発しました⁴⁶。イソフルランと酸素の送達は、手術中にオペレーターが即座に開始、維持、停止することが容易であり、腎臓IR-AKI手術に推奨されます。

最後に、腎椎弓根に近づく方法は、IR-AKI手術の質に影響を与える可能性があります。いくつかのIR-AKI研究では、腹腔が開かれ、腹膜と腸が腎臓にアクセスするために脇に押し出された正中開腹術を使用して腎椎弓根を調査しました。ただし、そうすることで、体液と熱の損失、手術関連の外傷、および手術期間が長くなる可能性があります^32,35。したがって、このプロトコルは、IR-AKI研究の背外側アプローチを提案しています体温を維持し、手術関連の損傷を最小限に抑えるために、脇腹と後腹膜から腎臓を露出させ、その後、手術状態を改善します研究の一貫性。

このモデルは、ROSC後の心停止によって引き起こされる両側性腎障害のマーカーを特定して特徴付けることを目的とした研究に応用できる可能性があります。ただし、処置中の外科的損傷によって放出されたサイトカインは、研究結果に影響を与える可能性があり、臨床シナリオに関連しなくなり、ベンチサイドからベッドサイドへの研究結果の翻訳が制限されます。

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Disclosures

著者は、この記事の公開に関して利益相反がないことを宣言します。

Acknowledgments

このモデルは、台湾科学技術部(MOST 109-2320-B-030-006-MY3)の資金援助を受けて開発されました。この原稿はWallace Academic Editingによって編集されました。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbable Suture, 6-0	Ethicon	J510G-BX
Betadine solution	Shineteh Istrument
Carprofen	Sigma	PHR1452
Cotton balls	Shineteh Istrument
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11051-10
Heating pad	Shineteh Istrument
Isoflurane	Piramal Critical Care Inc.	26675-46-7
Moria Vessel Clamp	Fine Science Tools	18320-11
Olsen-Hegar needle holder	Fine Science Tools	12002 - 12
Saline	Shineteh Istrument
Scalpel blades	Shinva	s2646
Small Animal Anesthesia Machine	Sheng-Cing Instruments Co.	STEP AS-01
Tissue scissors	Fine Science Tools	14072 - 10