Summary
Qui, descriviamo un nuovo metodo citometrico a flusso per l'isolamento prospettico dei progenitori eritroidi dell'unità esplosiva precoce (BFU-e) e dell'unità eritroide formante colonie (CFU-e) direttamente dal midollo osseo e dalla milza freschi di topo. Questo protocollo, sviluppato sulla base di dati trascrittomici a singola cellula, è il primo a isolare tutti i progenitori eritroidi del tessuto con elevata purezza.
Abstract
I primi progenitori eritroidi sono stati originariamente definiti dal loro potenziale di formazione di colonie in vitro e classificati in "unità" che formano scoppi e colonie note come BFU-e e CFU-e. Fino a poco tempo fa, non erano disponibili metodi per l'isolamento diretto prospettico e completo di progenitori puri di BFU-e e CFU-e da midollo osseo di topo adulto appena isolato. Per colmare questa lacuna, è stato analizzato un set di dati RNA-seq (scRNAseq) a singola cellula del midollo osseo di topo per l'espressione di geni che codificano per i marcatori di superficie cellulare. Questa analisi è stata combinata con saggi sul destino cellulare, consentendo lo sviluppo di un nuovo approccio citometrico a flusso che identifica e consente l'isolamento di sottogruppi completi e puri di progenitori BFU-e e CFU-e nel midollo osseo o nella milza di topo. Questo approccio identifica anche altri sottoinsiemi progenitori, inclusi sottoinsiemi arricchiti per potenziali basofili/mastociti e megacariociti. Il metodo consiste nell'etichettare le cellule fresche del midollo osseo o della milza con anticorpi diretti a Kit e CD55. I progenitori che esprimono entrambi questi marcatori sono quindi suddivisi in cinque popolazioni principali. La popolazione 1 (P1 o CFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71 med/high) contiene tutti i progenitori CFU-e e può essere ulteriormente suddivisa in P1-low (CD71med CD150high) e P1-hi (CD71 high CD150 low), corrispondenti rispettivamente a CFU-e precoce e tardiva; La popolazione 2 (P2 o BFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71low CD150high) contiene tutti i progenitori della BFU-e; La popolazione P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105 med/low CD150 low CD41low) è arricchita per i progenitori basofili/mastociti; La popolazione 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150high CD41+) è arricchita per i progenitori megacariociti; e la popolazione 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105 med/low CD150high CD41-) contiene progenitori con potenziale eritroide, basofilo/mastocitario e megacariocitico (EBMP) e progenitori multipotenziali (MPP) eritroidi/megacariocitici/basofili. Questo nuovo approccio consente una maggiore precisione nell'analisi dell'eritroide e di altri progenitori ematopoietici e consente anche di fare riferimento alle informazioni sul trascrittoma per ogni popolazione a flusso definita citometricamente.
Introduction
L'eritropoiesi può essere suddivisa in due fasi principali: eritropoiesi precoce e differenziazione eritroide terminale (Figura 1)1,2,3. Nell'eritropoiesi precoce, le cellule staminali ematopoietiche si impegnano nella linea eritroide e danno origine ai primi progenitori eritroidi, che sono stati identificati per la prima volta nel 1970 sulla base del loro potenziale di formazione di colonie in mezzo semi-solido 4,5,6,7,8,9 . In generale, i progenitori eritroidi sono divisi in due categorie: progenitori precedenti che danno origine ciascuno a un "burst" (un grande aggregato di cluster di cellule eritroidi più piccoli), chiamato "burst-forming unit erythroid" o BFU-e 4,5,6; e la loro progenie, che formano ciascuna un singolo, piccolo gruppo o colonia di cellule eritroidi, chiamato "unità eritroide formante colonie" o CFU-e 7,8,9. BFU-e e CFU-e non esprimono ancora geni eritroidi terminali e non sono morfologicamente riconoscibili. Dopo una serie di divisioni cellulari di auto-rinnovamento o espansione, la CFU-e subisce un passaggio trascrizionale in cui vengono indotti geni eritroidi come le globine, passando così alla differenziazione eritroide terminale (ETD)1,10. Durante l'ETD, gli eritroblasti subiscono da tre a cinque divisioni cellulari di maturazione prima dell'enucleazione per formare reticolociti, che maturano in globuli rossi.
Gli eritroblasti durante la differenziazione terminale sono stati originariamente classificati in base alla loro morfologia in proeritroblasti, basofili, policromatici e ortocromatici. L'avvento della citometria a flusso ha permesso il loro ordinamento prospettico e isolamento in base alle dimensioni delle cellule (misurate mediante forward scatter, FSC) e a due marcatori di superficie cellulare, CD71 e Ter11911,12,13 (Figura 1). Questo e simili approcci citometrici a flusso 14 hanno rivoluzionato lo studio degli aspetti molecolari e cellulari dell'ETD, consentendo l'analisi specifica dello stadio di sviluppo degli eritroblasti in vivo e in vitro 10,15,16,17,18,19,20. L'approccio CD71/Ter119 è ora utilizzato di routine nell'analisi dei precursori eritroidi.
Fino a poco tempo fa, un approccio citometrico a flusso simile e accessibile per l'isolamento prospettico diretto e ad alta purezza di CFU-e e BFU-e dal tessuto di topo è sfuggito ai ricercatori. Invece, i ricercatori hanno utilizzato strategie citometriche a flusso che isolano solo una frazione di questi progenitori, spesso in presenza di cellule non eritroidi che co-purificano all'interno degli stessi sottoinsiemi citometrici a flusso21. Di conseguenza, lo studio di BFU-e e CFU-e è stato limitato a sistemi di differenziazione in vitro che derivano e amplificano BFU-e e CFU-e da precedenti progenitori del midollo osseo. E' quindi possibile applicare strategie citometriche a flusso che distinguono CFU-e da BFU-e in queste colture eritroidi arricchite con progenitori22,23. Un approccio alternativo fa uso di CFU-e fetale e BFU-e, che sono altamente arricchiti nella frazione Ter119-negativa del fegato fetale di topo a metà gestazione 10,24,25. Nessuno di questi approcci, tuttavia, consente lo studio di BFU-e e CFU-e adulti nel loro stato fisiologico in vivo. L'entità della sfida può essere apprezzata quando si ricorda che, sulla base di saggi di formazione di colonie, queste cellule sono presenti nel midollo osseo adulto ad una frequenza di solo 0,025% e 0,3%, rispettivamente6.
Il protocollo qui descritto è un nuovo approccio citometrico a flusso basato sull'analisi trascrittomica a singola cellula di cellule midollari di topo Kit+ appena raccolte (Kit è espresso da tutte le prime popolazioni progenitrici del midollo osseo)1. Il nostro approccio contiene alcuni marcatori di superficie cellulare che erano già in uso da Pronk et al.21,26. I trascrittomi a singola cellula sono stati utilizzati per determinare combinazioni di marcatori di superficie cellulare che identificano eritroidi e altri progenitori ematopoietici precoci (Figura 2). In particolare, la frazione CD55+ delle cellule Kit+ lin-negative può essere suddivisa in cinque popolazioni, tre delle quali producono segmenti contigui della traiettoria eritroide (Figura 2). Le identità trascrittomiche di ciascuna di queste popolazioni sono state confermate mediante ordinamento, seguito da scRNAseq e proiezione dei trascrittomi monocellulari ordinati sulla mappa trascrittomica originale (l'espressione genica in ciascuna delle cinque popolazioni e l'intero set di dati del midollo osseo possono essere esplorati in https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . Il potenziale di destino cellulare di ciascuna delle popolazioni è stato confermato utilizzando saggi tradizionali di formazione di colonie (Figura 2), nonché un nuovo saggio di destino a singola cellula ad alto rendimento 1,27. Queste analisi mostrano che il nuovo approccio citometrico a flusso si traduce in un isolamento ad alta purezza di tutti i progenitori BFU-e e CFU-e del midollo osseo e della milza adulti freschi. In particolare, la popolazione 1 (P1) contiene solo CFU-e e nessun altro progenitore ematopoietico, e la popolazione 2 (P2) contiene tutti i progenitori BFU-e del midollo osseo e un piccolo numero di CFU-e ma nessun altro progenitore1. Il protocollo dettagliato di seguito è ulteriormente illustrato con un esperimento di esempio in topi a cui è stata iniettata soluzione salina o con l'ormone stimolante l'eritropoiesi (Epo).
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con i protocolli animali A-1586 e 202200017 approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Chan Medical School dell'Università del Massachusetts.
NOTA: Due protocolli sono dettagliati qui: primo, analisi citometrica a flusso (sezione 1), seguita da aggiustamenti di protocollo per l'ordinamento citometrico a flusso (sezione 2). Il protocollo seguente utilizza un citometro a flusso / selezionatore con 10 canali. Un esempio di configurazione è fornito nella tabella 1, di cui al punto 1.14.5. È anche possibile eseguire questo protocollo con solo nove canali; vedi la legenda nella tabella 2.
1. Analisi citometrica a flusso
- Eutanasia topi adulti (>6 settimane) Balb/C o C57BL6 utilizzando un metodo appropriato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (ad esempio, inalazione di CO2 seguita da lussazione cervicale). Per l'analisi citometrica a flusso, sarà sufficiente il midollo osseo (BM) di un singolo topo. Per l'ordinamento, il numero di mouse dipende dalle applicazioni a valle. La resa cellulare per ciascuna popolazione è riportata di seguito (fase 2.3.3).
- Raccolta dei tessuti:
- Preparare 5 mL di provette di selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS) contenenti 3 mL di tampone colorante freddo (4 °C) ("SB5": soluzione salina tamponata fosfato (PBS), albumina sierica bovina allo 0,2% (BSA), glucosio 0,08%, 5 mM EDTA) su ghiaccio. Usalo per posizionare i tessuti raccolti.
- Preparare tubi separati per ogni tessuto sezionato da ciascun topo. Non raggruppare tessuti da più topi.
- Raccogli entrambi i femori ed entrambe le tibie. Rimuovere tutti i muscoli dalle ossa prima di metterli nel tubo con SB5.
- Sezionare la milza attraverso un'incisione sul lato sinistro dell'addome.
- Estrazione delle cellule del midollo osseo:
- Posizionare i femori e le tibie appena sezionati direttamente nel tampone colorante freddo (SB5) e mantenere i tubi sul ghiaccio fino al momento di estrarre il midollo osseo (BM). Metti un mortaio sterilizzato pulito sul ghiaccio in un secchio. Trasferire le ossa alla malta insieme all'SB5 dal tubo.
- Tagliare circa 1 mm delle estremità di ciascun osso con le forbici per dissezione in modo che l'orifizio dell'osso diventi appena visibile.
- Utilizzare un ago da 26 G e una siringa da 3 ml riempita con SB5 per eliminare il midollo dalle ossa e raccoglierlo nel mortaio. Ripetere il processo 3-5 volte usando un tampone fresco ogni volta fino a quando le ossa appaiono incolori.
- Filtrare il midollo lavato attraverso un filtro a maglie da 100 μm e raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga da 50 ml posta sul ghiaccio.
- Utilizzare il mortaio e il pestello per schiacciare le ossa arrossate in 5-10 ml di SB5. Filtrare la miscela di ossa frantumate e tampone attraverso il filtro cellulare da 100 μm e il pool con le cellule raccolte nella fase 1.3.4.
- Estrazione delle cellule della milza:
- Installare un filtro a maglie da 100 μm su una provetta da centrifuga vuota da 50 ml posta sul ghiaccio. Posizionare una singola milza sul filtro a rete.
- Aggiungere 0,5-1 mL di SB5 alla milza per assicurarsi che non si asciughi.
- Utilizzando il lato in gomma di uno stantuffo per siringa da 3 ml o 5 ml, schiacciare la milza attraverso la rete. Aggiungere più SB5, 5 ml alla volta, e continuare a schiacciare fino a quando tutte le cellule sono state raccolte nel tubo.
- Da questo punto in poi, il midollo osseo e le cellule spleniche vengono trattati allo stesso modo.
- Far girare le cellule a 900 x g, 4 °C per 10 minuti. Aspirare il surnatante utilizzando una configurazione di aspirazione del vuoto.
- Per effettuare una sospensione a cella singola, risospendere le celle in 2 ml di SB5 e pipettare su e giù 50 volte usando un P1000 con una punta dell'orifizio grande (vedere Tabella dei materiali). Questi hanno ampie aperture della punta per aiutare a prevenire danni alle cellule fragili.
- Per contare le celle, risospendere mediante pipettaggio su e giù 20 volte. Diluire le cellule in un rapporto di 1:100 in SB5. Mescolare 10 μL delle cellule diluite con 10 μL di blu di tripano e contare su un emocitometro e/o un contatore cellulare.
- Far girare le cellule a 900 x g, 4 °C per 10 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule a 33 x 106 cellule vive/ml in SB5.
- Preparare il cocktail Lin-FITC mescolando volumi uguali di ciascun anticorpo nella Tabella 3.
- Preparare le celle per i controlli a colore singolo e i controlli "Fluorescenza meno uno" (FMO). Eseguire le fasi 1.11-1.12 in parallelo con la preparazione e la colorazione delle cellule campione nella fase 1.14 (campioni per analisi citometrica a flusso) e/o nella fase 2.1 (selezione citometrica a flusso).
- Preparare le cellule per un controllo cellulare non colorato trasferendo 50 μL (1,6 x 106 celle) della sospensione cellulare in un tubo FACS su ghiaccio. Preparare le celle per ogni singolo controllo del colore (11 tubi) trasferendo 50 μL (1,6 x 106 celle) della sospensione cellulare in un tubo FACS su ghiaccio.
- Preparare i controlli FMO per i seguenti colori (Kit, CD41, CD150, CD49f [quattro provette]) trasferendo 300 μL (10 x 106 celle) della sospensione cellulare in un tubo FACS separato su ghiaccio.
- Ruotare le cellule a 900 x g, 4 °C per 10 minuti e aspirare il surnatante.
- Colorazione anticorpale di FMO e controlli a colore singolo
- Colorare gli FMO a 33 x 106 celle/ml (in un volume totale di 300 μL) in tubi FACS. Per ogni controllo, aggiungere tutti gli anticorpi tranne l'anticorpo omonimo della FMO. Ad esempio, per il Kit FMO, omettere l'anticorpo Kit. Per ciascun anticorpo, utilizzare la diluizione e la concentrazione finale come indicato nella Tabella 2.
- Colorare i controlli monocolore a 20 x 106 celle/ml (in un volume totale di 50 μL) in tubi FACS; per ciascun controllo, aggiungere un singolo anticorpo alla concentrazione elencata nella Tabella 2.
- Vortice ogni tubo di controllo per 2-3 s a 3.000 giri / min (rotazioni al minuto), quindi incubare a 4 ° C, oscillando per 2,5 ore al buio, al riparo dalla luce. Scuotere i tubi con un asse di rotazione parallelo alla lunghezza del tubo, tra circa un angolo di 10° e 60° dall'orizzontale, in modo che il contenuto non tocchi il tappo.
- Lavare le celle con SB5: Portare il volume della sospensione cellulare a 4 ml con SB5. Ruotare le cellule a 900 x g, 4 °C per 10 minuti, e aspirare il surnatante.
- Sospensione cellulare:
- Risospendere i controlli non colorati e tutti i controlli a colore singolo (tranne il controllo DAPI) in 300 μL di SB5 e filtrare attraverso una rete filtrante da 40 μm in un nuovo tubo FACS.
- Produrre una soluzione DAPI/SB5 diluendo lo stock DAPI (1 mg/ml in etanolo al 100%) a 1:10.000 in SB5.
- Risospendere gli FMO in 1,8 mL di DAPI/SB5 e filtrare attraverso una rete filtrante da 40 μm in un nuovo tubo FACS
- Risospendere il controllo monocolore DAPI in 300 μL di DAPI/SB5 e filtrare attraverso una rete filtrante da 40 μm in un nuovo tubo FACS da 4 ml.
- Preparazione del campione: se le cellule vengono preparate per l'analisi citometrica a flusso, andare al punto 1.14. Se si preparano le celle per l'ordinamento, andare al passaggio 2.1.
- Colorare i campioni di analisi citometrica a flusso a 33 x 10 6 celle/ml in un volume totale di 300 μL (10 x 106 celle) in provette FACS:
- Preparare la miscela principale di anticorpi. Determinare il volume della miscela principale in base al numero di campioni, con 300 μL per campione. Preparare la miscela madre diluendo tutti gli anticorpi elencati nella Tabella 2 alla diluizione indicata in SB5. Il Rabbit IgG nel master mix funge da blocco Fc.
- Vortice ogni tubo per 2-3 s a 3.000 giri / min, quindi incubare a 4 ° C, oscillando per 2,5 ore al buio, al riparo dalla luce.
- Lavare le celle con SB5: Portare il volume della sospensione cellulare a 4 ml con SB5. Ruotare le cellule a 900 x g, 4 °C per 10 minuti, e aspirare il surnatante.
- Risospendere i campioni per l'analisi citometrica a flusso in 1,8 mL di DAPI/SB5 come preparato nella fase 1.12.5.2 e filtrare attraverso una rete filtrante da 40 μm in una provetta FACS.
- Analizzare i campioni su un citometro con 10 canali per ospitare i coniugati anticorpali nella Tabella 2 e il colorante di vitalità DAPI. Un esempio di configurazione del canale è fornito nella Tabella 1. È anche possibile utilizzare solo nove canali; vedere la legenda della Tabella 2 .
- Durante l'analisi dei dati di citometria a flusso, utilizzare approcci standard di compensazione spettrale con l'aiuto dei controlli a colore singolo e dei controlli FMO come descritto nel passaggio 2.4.
2. Adeguamenti del protocollo per la selezione citometrica a flusso
- Preparazione di Lin-
- Raggruppa tutte le cellule estratte dallo stesso tessuto (BM o milza) da 10 topi in un tubo da 50 ml. Risospendere ogni campione aggregato mediante pipettaggio utilizzando un P1000 con una punta dell'orifizio grande.
- Ruotare le cellule a 900 x g, 4 °C per 10 minuti e aspirare il surnatante.
- Preparare controlli monocolore e FMO come descritto nella sezione 1 utilizzando celle non arricchite.
- Arricchire le celle di Lin- per la selezione utilizzando l'arricchimento magnetico delle celle Lin :
- Risospendere le cellule a 1 x 108 cellule/ml con SB5 e trasferirle in un tubo da 15 ml. Aggiungere siero di ratto normale e gli anticorpi biotinilati elencati nella Tabella 4 e incubare con oscillazione a 4 °C per 1 ora.
- Ruotare le cellule a 900 x g, 4 °C per 10 minuti e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in 15 ml di SB5 freddo.
- Ruotare le cellule a 900 x g, 4 °C per 10 minuti e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule a 1 x 108 cellule/ml in SB5 freddo e tenerle sul ghiaccio.
- Vortice le nanosfere magnetiche a 3.000 giri / min per 5-10 s. Prendi 1 mL di nanosfere magnetiche per ogni 10 mL di cellule.
- Lavare le nanosfere in un tubo FACS da 5 ml. Portare il volume a 4 mL con SB5, centrifugare a 900 x g, 4 °C per 5 minuti e aspirare il surnatante.
- Risospendere le nanosfere in 500 μL di SB5 e mescolarle con le cellule preparate al punto 2.1.7. Incubare a 4 °C con oscillazione per 15 min.
- Ruotare le cellule a 900 x g, 4 °C per 10 minuti e aspirare il surnatante. Risospendere le celle a 1 x 108 celle/ml con SB5.
- Posizionare il tubo su un magnete a 4 °C per 5 minuti.
- Versare con cautela il surnatante in un nuovo tubo da 15 ml.
- Posizionare il tubo contenente il surnatante del punto 2.1.13 su un magnete a 4 °C per 5 minuti. Versare con cautela il surnatante in un nuovo tubo da 15 ml.
- Ruotare le cellule del surnatante al punto 2.1.14 a 900 x g, 4 °C per 10 minuti, e aspirare il surnatante.
- Risospendere le cellule arricchite di Lin in 1 mL di SB5.
- Diluire 10 μL delle cellule a 1:100 in SB5. Mescolare 10 μL delle cellule diluite con 10 μL di blu di tripano e contare su un emocitometro e/o un contatore cellulare.
- Sulla base del conteggio delle cellule nel passaggio 2.1.17, risospendere le cellule arricchite con Lin a 33 x 106 cellule/ml.
- Colorazione di cellule arricchite:
- Colorare i campioni di cellule arricchite a 33 x 106 cellule/ml in provette FACS aggiungendo tutti gli anticorpi elencati nella Tabella 2. Vortice ogni tubo per 2-3 s a 3.000 giri / min, quindi incubare a 4 ° C, oscillando per 2,5 ore al buio, al riparo dalla luce.
- Lavare le celle con SB5: Portare il volume dei tubi FACS a 4 ml con SB5. Ruotare le cellule a 900 x g, 4°C per 10 minuti, e rimuovere il surnatante.
- Risospendere i campioni per l'analisi citometrica a flusso in 4-6 ml di DAPI/SB5 come preparato al punto 1.12.5.2 e filtrare attraverso una rete filtrante da 40 μm in una nuova provetta FACS da 4 ml.
- Ordinamento dei campioni:
- Ordinare i campioni con un ugello grande e bassa pressione per massimizzare la resa CFU-e poiché le celle CFU-e sono facilmente danneggiabili ad alta pressione. Per il citometro a flusso utilizzato in questo studio, utilizzare 14 psi e un ugello da 100 μm o 12 psi con un ugello da 130 μm. Impostare le porte di smistamento come descritto al punto 2.4 di seguito.
- Preparare il tampone di raccolta: aggiungere il 20% di siero fetale bovino alla PBS.
- Per verificare la purezza delle popolazioni ordinate, eseguire nuovamente una piccola aliquota da ciascuna popolazione ordinata in un buffer contenente DAPI, come descritto nel passaggio 1.12.5.2.
NOTA: Tipicamente, BM da un totale di 10 topi (circa 1 x 109 cellule) produce almeno 50.000-100.000 cellule per ciascuna delle popolazioni P1-hi, P1-low e P2 con una vitalità di circa il 70%.
- Utilizzare la strategia di gating illustrata nella Figura 3 per l'analisi o l'impostazione delle porte di smistamento.
- Utilizzare il parametro forward-scatter (FSC) per rimuovere i detriti in base alle dimensioni. Utilizzare l'istogramma FSC-height rispetto all'istogramma dell'area FSC per escludere gli aggregati di celle e selezionare singole celle; ripetere l'operazione con l'altezza della dispersione laterale (SSC) rispetto all'istogramma dell'area SSC.
- Escludere le cellule morte eliminando le cellule che sono positive per il DAPI colorante del DNA, a cui le cellule vitali sono impermeabili.
- Selezionare le celle Lin-Ter119-Kit+ e, da queste, selezionare una sottopopolazione che esprima CD55.
- Suddividere le cellule Lin-Ter119-Kit+CD55+ in due popolazioni principali, P6 e P7, basate sull'espressione di CD49f e CD105.
- Sulla base dell'espressione di CD150 e CD41, suddividere ulteriormente P6 in P3 (progenitori basofili o mastociti), P4 (progenitori megacariocitici) e P5 (EBMP e MPP eritroide-biased).
- Sulla base dell'espressione di CD150 e CD71, suddividere ulteriormente P7 in P2 (BFU-e), CFU-e precoce (P1-bassa) e CFU-e tardiva (P1-hi).
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Representative Results
Il protocollo descrive un approccio citometrico a flusso per identificare BFU-es e CFU-es nelle cellule del midollo osseo e della milza appena raccolte. Inizia con la raccolta di BM fresco e milza dai topi e immediatamente mettendo il tessuto sul ghiaccio. Tutte le procedure sono condotte a freddo per preservare la vitalità cellulare. Le cellule sono marcate con un cocktail di anticorpi "lignaggio" che consente l'esclusione di tutte le cellule che esprimono marcatori di linee di sangue differenziate (il cocktail FITC-Lin, Tabella 3, nel caso dell'analisi citometrica a flusso; o l'arricchimento magnetico, Tabella 4, per le cellule negative al lignaggio). Le cellule sono anche etichettate con anticorpi contro i marcatori che ci permettono di distinguere un certo numero di popolazioni progenitrici precoci all'interno della frazione cellulare negativa del lignaggio. L'etichettatura è seguita dalla selezione citometrica a flusso o dall'analisi. L'approccio alla selezione citometrica a flusso è simile a quello dell'analisi citometrica a flusso, ma è preceduto dall'arricchimento magnetico delle sfere per la frazione delle cellule di Lin, per ridurre i tempi e le spese di selezione di un gran numero di cellule. Quando si selezionano i progenitori, BM viene raggruppato da più mouse, il numero dipende dall'applicazione a valle. Tipicamente, BM da un totale di 10 topi (circa 1 x 109 cellule) produce almeno 50.000-100.000 cellule per ciascuna delle popolazioni P1-hi, P1-low e P2 con una vitalità di circa il 70%.
La differenza fondamentale tra le popolazioni derivate dalla milza e dalla BM identificate da questo protocollo è la frequenza molto più bassa della popolazione P6 e delle sue sottopopolazioni, P4 / P5 / P3, nelle cellule derivate dalla milza.
Come esempio di analisi citometrica a flusso, è stato esaminato l'effetto della somministrazione di Epo nei topi. L'Epo si lega e attiva il recettore Epo (EpoR), che è essenziale sia per l'eritropoiesi basale che accelerata in condizioni di stress come l'ipossia. L'ipossia stimola un aumento dei livelli di Epo nel sangue 28,18, promuovendo a sua volta l'espansione di CFU-e 1,29 e precursori eritroidi.
Epo (0,25 U/g di peso corporeo) o un uguale volume di veicolo (soluzione salina) sono stati iniettati per via sottocutanea nei topi una volta ogni 24 ore per 3 giorni. Il BM e la milza sono stati raccolti a 72 ore. La stimolazione dell'Epo ha portato all'espansione delle popolazioni di CFU-e precoce e tardiva (P1-basso e P1-hi) sia nel BM che nella milza (Figura 4 e Figura 5).
Figura 1: Due fasi principali dell'eritropoiesi definitiva. L'eritropoiesi può essere suddivisa in una fase iniziale, in cui i progenitori sono definiti in base al loro potenziale di formazione di colonie, e una fase successiva nota come differenziazione terminale eritroide (ETD), in cui lo stadio eritroblastico è definito in base alla morfologia. Le tecniche citometriche a flusso hanno permesso l'isolamento prospettico di stadi eritroblastici specifici per lo sviluppo utilizzando FSC, Ter119 e CD71. Al contrario, non esiste un metodo equivalente per isolare i progenitori BFU-e e CFU-e direttamente da tessuti di elevata purezza. Si noti che viene mostrata solo una frazione della colonia BFU-e. La barra della scala si applica sia alle colonie CFU-e che BFU-e. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Una nuova strategia citometrica a flusso per isolare CFU-e e BFU-e direttamente dal tessuto. Questo manoscritto descrive un protocollo per identificare cinque nuove popolazioni citometriche a flusso, da P1 a P5, basato su un'analisi dei dati scRNAseq. (A) Proiezione grafica diretta dalla forza ("Spring plot") di trascrittomi monocellulari freschi del midollo osseo adulto Balb/C. I colori indicano il potenziale di destino cellulare previsto sulla base delle informazioni trascrittomiche e dell'algoritmo di analisi dell'equilibrio della popolazione (PBA)1. Sono indicate le regioni del grafico che corrispondono a ciascuna delle popolazioni citometriche a flusso da P1 a P5. Le regioni delineate sono approssimazioni disegnate a mano dei dati originali, che possono essere trovati in Tusi et al.1. La corrispondenza è stata confermata effettuando scRNAseq di ciascuna delle popolazioni selezionate da P1 a P51. E = eritroide; Ba = progenitori basofili o mastocitari; Meg = progenitori megacariociti; Ly = Progenitori linfocitari; D = progenitori dendritici; M = progenitori monocitici; G = progenitori granulocitici. (B) Saggi di formazione delle colonie, ritracciati da Tusi et al.1. Le popolazioni da P1 a P5 e le cellule CD55+ sono state ordinate come descritto in questo protocollo e ogni popolazione è stata placcata per i relativi saggi di formazione delle colonie. Le colonie eritroidi sono state segnate nei giorni indicati. UF = unifocale; MF = multifocale; CFU-MK = unità megacariocitica formante colonie; CFU-GM = unità formante colonie granulocitiche/monocitiche; CFU-GEMM = unità formante colonie granulocitiche, eritroidi, monocitiche, megacariocitarie. (C) Marcatori di superficie cellulare che definiscono ciascuna delle cinque popolazioni, nonché il loro potenziale di destino cellulare. Il potenziale di destino cellulare è sia il risultato di informazioni trascrittomiche che dei saggi sul destino cellulare, sia della formazione di colonie che dei saggi di destino di singole cellule 1,27. Da notare che la popolazione P1 è stata suddivisa in base all'espressione del marcatore CD71 in P1-hi e P1-low1. Sulla base dei dati di Tusi et al.1. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Strategia di gating citometrico a flusso. La strategia di gating completa per le popolazioni da P1 a P5. Il midollo osseo appena raccolto (BM) o la milza (SP) da un topo Balb / C iniettato per via sottocutanea con 100 μL di soluzione salina sterile allo 0,9% vengono prima controllati per la popolazione principale, scartando i detriti; questo è seguito dalla selezione di singoletti, scartando le cellule morte e gating su cellule che sono Ter119-negative, lignaggio-negative, ed esprimono Kit. Un'ulteriore suddivisione di Ter119-Lin-Kit+CD55+ in P6 e P7 è seguita dalla suddivisione finale in popolazioni da P1 a P5 (vedi anche Figura 2). Il canale Ter119 permette l'analisi degli eritroblasti sullo stesso campione (utilizzando l'approccio Ter119/CD7112). Tuttavia, un canale Ter119 separato non è essenziale per questo protocollo e l'anticorpo Ter119 può essere omesso dal master mix e incluso come parte del cocktail Lin-FITC. Il passaggio di esclusione per le cellule Ter119 positive non è mostrato in questa strategia di gating. I numeri sono percentuali di ogni porta all'interno dell'istogramma mostrato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Analisi dei progenitori eritroidi precoci del midollo osseo e della milza dopo stimolazione dell'Epo. Grafici citometrici a flusso rappresentativi del midollo osseo (BM) o della milza (SP) appena raccolti. I topi Balb/C sono stati iniettati per via sottocutanea con 0,25 U/g di peso corporeo di Epo o con un volume equivalente di soluzione salina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: La risposta dei progenitori BM e milza all'Epo in vivo. Statistiche riassuntive che mostrano le variazioni del numero assoluto di cellule nelle popolazioni da P1 a P5 dopo iniezione di Epo in cellule di midollo osseo (A) appena raccolte e (B) di milza; *p = 0,02. Esperimento come descritto nella Figura 4. n = 4 topi in ogni gruppo. Per calcolare il numero assoluto di cellule, la frequenza delle cellule in ciascuna popolazione nel BM o nella milza (dalla Figura 4) è stata moltiplicata per il numero totale di cellule BM o milza raccolte da ciascun topo e divisa per il peso del topo in grammi. Da notare che solo la CFU-e precoce nel BM ha raggiunto la significatività statistica (p = 0,02), probabilmente una combinazione di una dose di Epo relativamente bassa e un piccolo numero di topi in ciascun gruppo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Array di rivelatori | PMT | Specchio dicroico | Filtro passa-banda | Fluoroforo rilevato |
| Laser blu (488 nm) | Un | 685LP | 695/40 | |
| B | 505LP | 530/30 | Lin-FITC (+Ter119-FITC) | |
| C | 488/10 | |||
| Laser viola (405 nm) | Un | 760LP | 800/80 | |
| B | 630LP | 660/20 | CD150-BV650 | |
| C | 595LP | 605/20 | CD41-BV605 | |
| D | 475LP | 525/20 | ||
| E | 450/50 | CD49f-BV421 | ||
| Laser rosso (640 nm) | Un | 755LP | 785/50 | cKit-APC-Cy7 |
| B | 700 LP | 720/30 | ||
| C | 675/14 | CD55-AF 647 | ||
| Laser UV (355 nm) | Un | 505LP | 525/20 | |
| B | 420LP | 450/50 | DAPI | |
| C | 379/28 | Ter119-BUV 395 | ||
| Laser YG (561 nm) | Un | 755LP | 780/60 | CD71-PE-Cy7 |
| B | 685LP | 710/50 | ||
| C | 635LP | 660/20 | ||
| D | 600LP | 610/20 | ||
| E | 570LP | 580/20 | CD105-PE |
Tabella 1: Esempio del layout del canale in un citometro LSRII. Il pannello di anticorpi utilizzati nel protocollo descritto e la loro disposizione nel citometro a flusso LSRII per raccogliere i dati.
| Reagente o Anticorpo | Coniugare | Stock conc. (mg/ml) | Fattore di diluizione | Conc. finale in sospensione cellulare (μg/mL) | Clone |
| CD71 | PE/Cy7 | 0.2 | 2000 | 0.1 | RI7217 |
| TER-119 · | BUV395 | 0.2 | 100 | 2 | TER-119 · |
| CD55 (DAF) | AF647 · | 0.5 | 50 | 10 | RIKO-3 · |
| CD105 | PE | 0.2 | 50 | 4 | MJ7/18 |
| CD150 (SLAM) | BV650 | 0.1 | 50 | 2 | TC15-12F12.2 |
| CD49f | BV421 | 0.025 | 50 | 0.5 | GoH3 |
| CD41 | BV605 | 0.2 | 100 | 2 | MWReg30 |
| CD117 (cKit) | APC/Cy7 | 0.2 | 200 | 1 | 2B8 |
| Cocktail Lin | FITC | 0,08 (per ogni anticorpo nel cocktail) | 83 | 1 (per ogni anticorpo nel cocktail) | |
| Coniglio IgG | 10 | 50 | 200 |
Tabella 2: Componenti del master-mix di anticorpi. Composizione del master mix di anticorpi. Il canale Ter119 permette l'analisi degli eritroblasti sullo stesso campione (utilizzando l'approccio Ter119/CD7112). Tuttavia, un canale Ter119 separato non è essenziale per questo protocollo e l'anticorpo Ter119 può essere omesso dal master mix e incluso come parte del cocktail Lin-FITC.
| Reagente o Anticorpo | Coniugare | Stock conc. (mg/ml) | Clone |
| Ly-6G e Ly-6C | FITC | 0.5 | RB6-8C5 |
| CD11b | FITC | 0.5 | M1/70 |
| CD19 | FITC | 0.5 | 1D3 |
| CD4 | FITC | 0.5 | RM4-5 |
| CD8a | FITC | 0.5 | 53-6.7 |
| F4/80 | FITC | 0.5 | BM8 |
Tabella 3: Componenti del cocktail Lin. Composizione del cocktail Lin utilizzato come parte della miscela principale di anticorpi (vedere i dettagli della miscela master nella Tabella 2).
| Reagente o Anticorpo | Coniugare | Stock conc. (mg/ml) | Fattore di diluizione | Conc. finale in sospensione cellulare (μg/mL) | Clone |
| Ly-6G e Ly-6C | Biotina | 0.5 | 200 | 2.5 | RB6-8C5 |
| CD11b | Biotina | 0.5 | 200 | 2.5 | M1/70 |
| CD19 | Biotina | 0.5 | 200 | 2.5 | 1D3 |
| CD4 | Biotina | 0.5 | 200 | 2.5 | RM4-5 |
| CD8a | Biotina | 0.5 | 200 | 2.5 | 53-6.7 |
| F4/80 | Biotina | 0.5 | 200 | 2.5 | BM8 |
| TER-119 · | Biotina | 0.5 | 200 | 2.5 | TER-119 · |
| Siero di ratto normale | 50 |
Tabella 4: Anticorpi per l'arricchimento magnetico. Anticorpi utilizzati per arricchire la frazione Lin- del BM o della milza prima della selezione cellulare.
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Discussion
La capacità di isolare prospetticamente i progenitori BFU-e e CFU-e direttamente da tessuti freschi con elevata purezza era precedentemente sfuggita ai ricercatori. Il nostro nuovo approccio, convalidato utilizzando scRNAseq e saggi sul destino cellulare 1,27, offre ora gli strumenti per farlo.
Ci sono una serie di punti chiave per eseguire con successo sia i protocolli di ordinamento che quelli analitici. In primo luogo, le cellule devono essere filate a 900 x g per prevenire la perdita di cellule a bassa densità. Molte cellule allo stadio CFU-e sono grandi cellule a bassa densità che altrimenti potrebbero essere perse. In secondo luogo, è necessario utilizzare grandi punte dell'orifizio quando si esegue il pipettaggio su e giù per aiutare a rompere gli aggregati cellulari e prevenire la perdita di fragili cellule P1 e P2. Questo passaggio è importante poiché molti progenitori CFU-e sono associati a macrofagi delle isole eritroblastiche (EBI) e andrebbero persi se non dissociati con successo. In terzo luogo, le cellule vengono incubate con un tampone contenente EDTA ("SB5") prima della colorazione, che aiuta a dissociare gli EBI. In quarto luogo, durante l'acquisizione dei dati citometrici a flusso, la velocità di acquisizione non deve superare 7.000 eventi/s o la velocità raccomandata per lo strumento citometrico a flusso utilizzato.
Le popolazioni P1 e P2 contengono tutti i progenitori CFU-e e BFU-e nel midollo osseo, rispettivamente, e non contengono altri tipi di cellule progenitrici1. La popolazione P1 è ulteriormente suddivisa in CFU-e precoce (P1-bassa) e CFU-e tardiva (P1-hi) sulla base dell'espressione di CD711. Queste popolazioni citometriche a flusso altamente puro forniscono un quadro completo delle popolazioni progenitrici BFU-e e CFU-e in vivo.
Uno svantaggio è che la popolazione P2 contiene una piccola frazione dei primi progenitori CFU-e. Tuttavia, contiene tutte le cellule BFU-e nel BM e nessun altro tipo di cellula. La popolazione P1 contiene tutta la CFU-e nel BM, ad eccezione della piccola frazione presente in P2. A differenza delle popolazioni P1 e P2, le popolazioni progenitrici da P3 a P5 sono popolazioni progenitrici altamente arricchite, ma non pure.
L'applicazione di questo strumento citometrico a flusso a modelli murini di eritropoiesi consentirebbe ora la determinazione delle risposte cellulari e molecolari durante le perturbazioni fisiologiche e patologiche all'eritropoiesi. Nell'esempio mostrato, ai topi è stato iniettato l'ormone Epo. Questo approccio può essere utilizzato in topi geneticamente modificati, ad esempio in modelli murini di emoglobinopatie, per un'analisi molecolare più accurata dei loro progenitori eritroidi alterati in vivo.
DISPONIBILITÀ DEI DATI:
Ulteriori dati associati agli esperimenti nella Figura 4 e nella Figura 5 sono disponibili su richiesta.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato dalle sovvenzioni NIH R01DK130498, R01DK120639 e R01HL141402
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575020 | |
| 1000 µL large orifice tips | USA sceintific | 1011-9000 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody | BioLegend | 131806 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody | BioLegend | 105826 | |
| Biotin-CD11b | BD Biosciences | 557395 | M1/70 (clone) |
| Biotin-CD19 | BD Biosciences | 553784 | 1D3 (clone) |
| Biotin-CD4 | BD Biosciences | BDB553045 | RM4-5 (clone) |
| Biotin-CD8a | BD Biosciences | BDB553029 | 53-6.7 (clone) |
| Biotin-F4/80 | Biolegend | 123106 | BM8 (clone) |
| Biotin-Ly-6G and Ly-6C | BD Biosciences | 553125 | RB6-8C5 (clone) |
| Biotin-TER-119 | BD Biosciences | 553672 | TER-119 (clone) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma aldritch | A1470 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313624 | |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody | BioLegend | 133921 | |
| Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody | BioLegend | 115931 | |
| BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells | BD Biosciences | 563827 | |
| ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 011-000-003 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | |
| Digital DIVA hardware and software for LSR II | BD Biosciences | ||
| FITC anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123108 | |
| FITC Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 557396 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD19 | BD Biosciences | 553785 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 553047 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553031 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C | BD Biosciences | 553127 | |
| FlowJo software | FlowJo | version 10 | Flow cytometer analysis software |
| LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle Set | Amazon | ||
| Normal rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| PE anti-mouse CD105 Antibody | BioLegend | 120408 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody | BioLegend | 113812 | |
| Phosphate Buffered Saline, 10x Solution | Fisher scientific | BP3994 | |
| Streptavidin Nanobeads | BioLegend | 480016 | Magnetic beads |
References
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