Drosophila Quantificação da Junção Neuromuscular (NMJ): Um método para avaliar a morfologia e a função sinapática

Overview

A junção neuromuscular Drosophila (NMJ) é usada como modelo para estudar a morfologia e a função das sinapses. Este vídeo descreve características importantes que os pesquisadores quantificam para caracterizar o NMJ. O protocolo de exemplo demonstra um software capaz de realizar a quantificação automaticamente.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Castells-Nobau et al., Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology, J. Vis. Exp. (2017).

1. Requisitos antes do processamento de imagens

1. Realize os preparativos do livro aberto de Drosophila da terceira larva errante instar (L3), como descrito anteriormente.
2. Terminais de NMJ de co-imuno-immunolabel Drosophila utilizando uma combinação de dois marcadores: Dlg-1 ou Hrp juntamente com Brp para análise com "Drosophila NMJ Morphometrics", e Syt ou Csp juntamente com Brp para análise com "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
   NOTA: Anticorpos da mesma espécie podem ser combinados pré-rotulando um com um kit de conjugação de anticorpos, como os Kits de Rotulagem Zenon Alexa.
3. Terminais de NMJ de imagem usando um microscópio de escolha, por exemplo, fluorescência (com ou sem ApoTome) ou microscopia confocal.
   1. Adquira uma pilha de imagens de 2 canais do terminal NMJ.
      1. Ajuste as configurações do microscópio de forma que o canal 1 adquira o terminal NMJ imunolabeled com Dlg-1 (ou Hrp, Syt, Csp) e o canal 2 do terminal NMJ imunolabeled com Brp.
      2. Opcionalmente, analise imagens de um canal (de sinapses imunolabeled com um único anticorpo) com as macros. Imagem NMJs imunolabeled exclusivamente com Dlg-1 ou Hrp para análise com "Drosophila NMJ Morphometrics", ou Syt ou Csp para "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
         NOTA: Não é possível analisar sinapses imunossu detidas apenas com anti-Brp.
   2. Exporte as imagens obtidas como arquivos .tiff individuais. Inverta a ordem do canal antes de executar as macros se não for adquirido como indicado.

2. Requisitos e Instalação de software

1. Baixe as macros: "Drosophila NMJ Morphometrics" e "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" do seguinte site: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1.
2. Mova o cursor para a pasta "Macros update 1", e clique na opção de aparecer "exibir". Uma lista com o conteúdo desta pasta será exibida. A pasta contém as macros "Drosophila NMJ Morphometrics" e "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
   NOTA: Ambas as macros são compatíveis com as versões 1.4 de Fiji, que também são fornecidas na mesma pasta. As macros podem não ser executadas em versões recentes. Por favor, utilize a versão 1.4 fornecida. Não é problema iniciar esta versão, mesmo em computadores com uma versão Fiji mais recente disponível.
3. Clique em "Baixar tudo". O conteúdo da pasta será baixado para o computador como um arquivo .zip. Descompactar o arquivo baixado.
4. Copie os arquivos Drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm e Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm para Fiji.app/plugins/ diretório. Ao reiniciar o programa, as macros aparecerão na parte inferior do menu suspenso plugins.

3. Execute sub-macro "Convert to Stack" para criar projeções Z e hyperstacks das Imagens NMJ

1. Inicie a interface gráfica selecionando Plugins na barra de ferramentas e escolha "Drosophila NMJ Morphometrics" no menu suspenso.
2. Defina a configuração "Unique File String" na interface gráfica da macro.
   NOTA: O software de microscópio usa uma assinatura de identificação para organizar planos e canais ao armazenar pilhas como arquivos individuais '.tiff. A configuração de sequência de arquivos exclusiva inserida precisa especificar a assinatura atribuída pelo software ao primeiro plano do primeiro canal (importante: o menor número de plano e canal precisa ser indicado).
3. Selecione apenas a sub-macro "Converta-se em pilha" e clique em "ok" e selecione a pasta onde as imagens estão localizadas. Se um diretório principal com várias subpastas for selecionado, todos os arquivos individuais '.tiff dentro do diretório principal e subpasta que correspondem aos critérios exclusivos de sequência de arquivos serão processados.
   1. Se a pilha z contiver apenas um canal, selecione a caixa "Somente canal 1".
4. Observe que dois novos arquivos por imagem NMJ, por padrão denominado como stack_image_name e flatstack_image_name aparecerão. Armazene apenas essas pilhas e flatstack para análise suplementar. A série de arquivos .tiff pode ser excluída neste momento, minimizando as capacidades de armazenamento necessárias e evitando possíveis fontes de erro.

4. Execute a Sub-macro "Definir ROI" para delinear o Terminal de Interesse do NMJ

1. Inicie a interface gráfica de "Drosophila NMJ Morphometrics".
2. Selecione apenas a caixa de seleção "Defina ROI" e pressione "OK" e selecione o diretório principal onde as imagens intituladas flatstack_name são armazenadas e pressione "Selecionar". A sub-macro "Definir ROI" é pesquisada automaticamente através de todas as subpastas dentro do diretório principal selecionado.
3. À medida que a primeira projeção é aberta, selecione a ferramenta "Seleções à mão livre" na barra de ferramentas.
4. Usando o mouse desenhe uma seleção que contém exclusivamente o terminal completo de interesse do NMJ e clique em "OK" na janela "Definir terminal". A macro prosseguirá com a próxima projeção.
5. Delineie o próximo ROI e repita até que todos os ROIs sejam definidos. O arquivo de imagem ROI, chamado "roi_image_name", será armazenado no mesmo diretório das imagens de pilha e projeção geradas anteriormente para cada uma das imagens processadas. A saída deste sub-macro é uma imagem binária do ROI em branco em um fundo preto.

5. Executar sub-macro "Analisar" para quantificar características do terminal NMJ

1. Vá para a barra de ferramentas, selecione "Plugins" e use:
   "Drosophila_NMJ_Morphometrics" ao analisar as sinapses imunolabeled com anti-Dlg-1 ou anti-Hrp (canal 1) juntamente com anti-Brp (canal 2), ou "Drosophila_NMJ_Bouton_Morphometrics" ao analisar sinapses imunolatered com anti-Syt ou anti-Csp (canal 1) juntamente com Brp (canal 2).
   1. Quando uma pilha de imagens de canal deve ser analisada (o canal estrutural Dlg-1 ou HRP para "Drosophila_NMJ_Morphometrics", ou Syt ou Csp para "Drosophila_NMJ__Bouton_Morphometrics"), selecione a caixa "Somente canal 1".
2. Ajuste a escala correspondente às imagens a serem analisadas.
   1. Se um pixel na imagem corresponder a 2,5 μm, indicar Scale-Pixels = 1, Scale-Distance em μm = 2,5. Caso ambas as configurações sejam deixadas em 0, a área NMJ, perímetro, comprimento e maior comprimento do ramo serão expressas em número de pixels.
3. Se necessário, ajuste as configurações de análise padrão da macro. Realize os ajustes somente se a sub-macro "Analisar" tiver sido executada anteriormente com resultados insatisfatórios (veja o final desta seção e a seção 6 para instruções de como otimizar as configurações).
4. Selecione as caixas de seleção "Analisar" e "Esperar" e pressione "OK".
   1. Selecione a caixa de seleção "Esperar" ao executar a sub-macro "Analisar" em imagens de 2 canais. Caso contrário, erros na contagem de zonas ativas podem ocorrer devido a capacidades limitadas do computador.
5. À medida que uma nova janela "Escolha um Diretório" é aberta, selecione o diretório onde as imagens estão localizadas e pressione "selecionar". A macro analisará todas as imagens armazenadas no diretório principal e, se aplicável, pastas subsequentes (usando os três arquivos da execução das sub macros anteriores: stack_image_name, flatstack_image_name e roi_image_name). A macro processa cada imagem individual e consecutivamente. Isso pode levar vários minutos por pilha de imagens (dependendo da capacidade do computador).
6. Após executar a macro, observe que um novo arquivo de imagem chamado res_image_name para cada sinapse analisada armazenada será criado na pasta parental. As medidas quantitativas serão armazenadas como arquivo "resultados.txt".
7. Inspecione todas as imagens de resultado para detectar e excluir imagens com erros de segmentação. Possíveis erros de segmentação são descritos na Tabela 1,juntamente com conselhos de como ajustar as configurações para contornar esses erros. As imagens de resultado com tais erros de segmentação são fornecidas como exemplos na Figura 1.
   NOTA: Ao executar a macro com as configurações padrão observadas na interface do usuário, houve uma precisão de aproximadamente 95% quando a avaliação macro foi comparada à avaliação manual.

6. Ajuste as configurações de macro nas imagens

1. Quando mais de 5% das imagens apresentarem erros de segmentação, explore os diferentes algoritmos para definir/escolher as configurações macro mais adequadas para as imagens.
2. Ajuste o valor do raio da bola rolando
   NOTA: A função de raio de bola rolando subtrai o fundo da imagem. Essa função é de importância crucial ao trabalhar com imagens adquiridas em microscópios de fluorescência e/ou quando as imagens têm alto ruído de fundo. A subtração do fundo ajudará as etapas de auto-limiar da macro a produzir segmentação adequada dos terminais NMJ.
   1. Selecione três imagens stack_image_name NMJ geradas pela sub-macro "Converta-se em pilha". Escolha imagens representativas para o conjunto de dados da imagem.
   2. Na barra de ferramentas, selecione | de imagem | de cor Canais divididos. Serão criadas duas pilhas de imagens, uma representando o canal 1 e a outra do canal 2, respectivamente e salva-as.
   3. Abra a pilha de imagens pertencente ao canal 1 aberto, correspondente ao imunolabeling Dlg-1, Hrp, Syt ou Csp.
   4. Execute o filtro "Subtrair fundo" selecionando "Process" na barra de ferramentas seguido de "Subtrair fundo..." no menu suspenso.
   5. Clique na caixa de seleção de visualização na janela pop-up e ajuste o raio da bola rolando para o valor mais apropriado para as imagens. A configuração "Raio de bola rolando" deve ser ajustada a valores que aumentam o contraste entre sinapse e fundo (ver Figura 2A').
      1. Consulte a Figura 2 como exemplo. No painel A, partes da sinapse mostram os mesmos níveis cinzentos que o fundo, enquanto na Figura 2 o painel A' um "raio de bola rolando" de 500 resulta em forte contraste entre a sinapse e o fundo.
   6. Crie uma projeção z selecionando na barra de ferramentas Imagem | Stack| Z-projeção, escolha tipo de projeção = Intensidade Máxima e salve a imagem resultante. Quando o valor apropriado para o raio da bola rolando for definido, execute o algoritmo "Subtrair fundo" nas imagens representativas restantes com o mesmo valor do raio da bola rolando. Crie as projeções Z e salve-as (em qualquer diretório).
      NOTA: O valor do raio da bola rolando para imagens de 8 bits ou RGB deve ser pelo menos tão grande quanto o raio do maior objeto na imagem que não faz parte do fundo. Para imagens de 16 bits e 32 bits, o raio deve ser inversamente proporcional à faixa de valor do pixel.
3. Determine os diferentes limites automáticos que serão usados
   1. Abra as projeções Z salvas na etapa anterior (6.2.6) e selecione | de imagem Ajuste | | autothreshold Tente tudo.
   2. Como uma imagem de resultado binário limiar aparecerá com todos os diferentes algoritmos de limiar automático, determine o algoritmo mais adequado para as imagens.
      1. Ao executar a macro mais tarde, altere o limiar nas configurações de macro de acordo.
      2. Use limiares mais restritivos, como "RenyiEntrophy" ou "Moments" como o limiar de contorno do NMJ e limiares mais permissivos, como "Li" para determinar o esqueleto NMJ e "Huang" para determinar zonas ativas. Quando as imagens são muito nítidas com pouco ou nenhum fundo, use "Huang" como limite de contorno NMJ. Caso contrário, partes da sinapse podem estar faltando após a segmentação da imagem.
      3. Consulte a Figura 2B para um exemplo. A segmentação adequada da sinapse é obtida com limiares automáticos destacados por caixas verdes. Alguns exemplos de limiares não adequados são destacados por caixas vermelhas (verifique sinapses em alta ampliação). Neste último, as partes da sinapse estão faltando ou partes do fundo estão incluídas.
4. Determine o tamanho máximo das pequenas partículas
   NOTA: Esta função excluirá todas as partículas detectadas pelo limiar de contorno do NMJ e pelo limiar esqueleto que são menores do que o valor definido na "configuração de pequenas partículas" da análise. Este valor é definido em pixels. Esta função serve como um filtro de ruído e é muito útil quando altas taxas de fundo não uniforme (como cristais/poeira) estão presentes nas imagens obtidas.
   1. Abra as projeções Z salvas na etapa 6.2.6. e definir a escala para detectar o número de pixels via Analyze | Definir escala. Aplique as seguintes configurações: distância em pixels = 1, distância conhecida = 1, proporção de pixel = 1, Unidade de comprimento = pixel e pressione "Ok". Clique na ferramenta "Seleção Oval" na barra de ferramentas.
   2. Usando o mouse, desenhe uma seleção em torno de partículas únicas que estão presentes na imunostaining, mas que não pertencem ao NMJ. Pressione Ctrl+m para um usuário do Windows ou cmd+m para usuários de Mac. Uma janela de resultado será aberta, indicando a área das partículas selecionadas em número de pixels.
   3. Repita a etapa anterior várias vezes com vários artefatos presentes nas imagens para determinar a maior área contaminante de partículas/artefatos. Este será o valor a ser definido na configuração ao executar a macro mais tarde. Ao executar o macro definir o "Tamanho de Pequenas Partículas" como o menor tamanho de partícula observado pus uma margem de 25%.
   4. Consulte a Figura 2D para obter um exemplo. O maior cristal detectado tem uma área de 112 pixels. A configuração "Tamanho de pequenas partículas", ao processar esta imagem com a macro, deve ser definida para 125 - 150.
5. Determine o tamanho mínimo de bouton
   NOTA: Esta função excluirá todos os boutons detectados pelo limiar de contorno do NMJ que são menores do que o valor definido da análise. Este valor é definido em pixels.
   1. Siga os mesmos passos descritos na seção 6.4, mas neste caso desenhe uma seleção em torno dos menores boutons presentes no terminal NMJ. Escolha a menor área correspondente ao menor bouton dos medidos. Este é o valor a ser definido na configuração de tamanho de bouton mínimo ao executar a macro mais tarde.
6. Defina o valor "tolerância ao ruído maxima"
   1. Para definir o valor "Encontrar tolerância máxima de ruído" para a macro, abra a pilha Z do canal 2 salva na seção 6.2.2.
   2. Vá para a guia plugins no menu pop-up, selecione Process | Máximo (3D) e quando o maximum_image_name aparecer (o que pode levar alguns minutos), feche a pilha de imagens original.
   3. Selecione o Maximum..._image_name (a pilha de imagens recém-obtida) e selecione Plugins | | processos Mínimo (3D), quando a nova imagem Mínima de Maximum..._image_name apears fecha a pilha máxima... _image_name.
   4. Na barra de ferramentas, selecione Process | Encontre Maxima... Uma nova janela "Encontre maxima..." vai abrir. Clique na caixa de seleção "Seleção de ponto de visualização..." e preencha a caixa "Tolerância ao ruído" com a configuração de macro padrão 50. Os pontos máximos serão indicados na imagem como pequenas cruzes.
      1. Aumente o valor de "tolerância ao ruído" se observar um excesso de zonas ativas anotadas, ou seja, cruzes que não estão no topo de zonas ativas que não estão em foco no plano de pilha selecionado ou zonas ativas falsas que são detectadas em segundo plano.
         1. Por outro lado, se observar zonas ativas incompletamente anotadas, ou seja, zonas ativas em foco não sendo reconhecidas, diminua o valor de "tolerância ao ruído maxima". Continue tentando valores diferentes após este procedimento até que as cruzes estejam rotulando adequadamente zonas ativas em foco. Preencha a "Encontrar tolerância máxima ao ruído" com este valor.
         2. Consulte a Figura 2C para obter um exemplo. Muitas zonas ativas são detectadas. Na Figura 2C, apenas as zonas ativas em foco são detectadas ao aumentar o valor de "tolerância ao ruído maxima".
   5. Execute a sub-macro "Analisar" para as imagens representativas selecionadas na etapa 5.1, com as configurações definidas em todas as etapas anteriores.
7. Ajuste brp-puncta limiar inferior e superior
   1. Observe que um novo arquivo aparecerá após executar a macro de acordo com a etapa 6.6, chamada 2_active_zone_stack_image_name. Nesta pilha de imagens, as zonas ativas detectadas pela função "Encontrar maxima" são indicadas por pontos brancos em cada plano.
   2. Abra este arquivo arrastando-o e soltando-o na barra de ferramentas e selecione Imagem | Empilhar | | de projeto Z Tipo de projeção = Fatias de soma. Uma projeção do 2_active_zone_stack_image_name será obtida.
   3. Selecione | de imagem Ajuste | limiar. Uma nova janela "Limiar" será aberta. Deslize a barra superior para escolher um valor limiar onde, todos os focos desejados/Brp positivo são visualizados em vermelho.
      NOTA: Se o limiar for definido muito baixo, um excesso de zonas ativas será contado. Se estiver muito alta, uma fração das zonas ativas será perdida.
      1. Consulte a Figura 2E para obter um exemplo. Quando o limiar é definido para 400, a maioria das zonas ativas (simbolizadas como um foco de 1 pixel) não estão incluídas na segmentação, uma vez que não são destacadas em vermelho(Figura 2E). Quando o limiar é definido para um valor de 50 todas as zonas ativas são destacadas em vermelho(Figura 2E).
   4. Defina esse valor como um limite mínimo. Deixe "Limiar de puncta superior" no valor máximo.
   5. Recorte a sub-macro "Analisar" para as imagens representativas com as configurações definidas em todas as etapas anteriores desta seção. Avalie criticamente os arquivos de imagem resultantes e certifique-se de que a segmentação seja feita corretamente. Se este não for o caso, reajuste as configurações de acordo com a natureza dos erros de segmentação (Figura 1, Tabela 1).

Representative Results

Figura 1: Exemplos de resultados inadequados de macro segmentação. Imagens de resultado após executar "Drosophila NMJ Morphometrics" ou "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics". Partes do terminal sináptico não estão incluídas no contorno amarelo (A). Partes do fundo estão incluídas no terminal sináptico pelo contorno amarelo(B). Linha de esqueleto azul se estende além do terminal sináptico(C - D). Muitas zonas ativas são detectadas(E - E). Algumas zonas ativas permanecem sem ser detectadas pela análise(G - G'). Zonas ativas são detectadas fora da sinapse (F). Segmentação de bouton incorreta (Só aplicável ao executar Drosophila NMJ Bouton Morphometrics), boutons são perdidos (H) ou muitos boutons são detectados pela segmentação (I). Partículas como cristais ou poeira que fazem parte do fundo estão incluídas na segmentação (J). Informações sobre como alterar configurações para evitar esses erros são fornecidas na Tabela 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Exemplos de ajustes de configuração de macrose suas consequências para a segmentação de imagens. (A) Subtrair a visualização de fundo de um sinapse imunolabeled DLG-1, retratado em um microscópio de fluorescência com ApoTome, quando "Raio de bola rolando" é definido para 20 (A) ou 500(A'). (B) Imagens de saída obtidas após a execução de | de imagem Ajuste | | de limiar automático Tente todas as segmentações de imagem obtidas pelos 16 algoritmos de limiar automático diferentes. (C) pré-visualização "Find Maxima" ao configurar "Tolerância ao ruído" a 50 (C) e 500(C'); As zonas ativas detectadas pela segmentação são rotuladas por uma pequena cruz. (D) Medição das "pequenas partículas" que aparecem no fundo da imagem de um imunolaculado sinapse com anti-Hrp, imagedo em um microscópio confocal. (E) projeção "Fatias de soma" obtidas a partir do ge_name 2_active_zone_stack_ima. O limite é fixado em 400 (E) e em 50(E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

segmentação	Erros observados	exemplo	Ajustes necessários
Área e perímetro da NMJ (Representado por contorno amarelo na imagem de resultado)	Partes do terminal sináptico não estão incluídas no contorno amarelo ou partes do fundo estão incluídos no terminal sináptico delineado em amarelo.	Figura 2A-B	Ajuste o valor 'Raio da Bola Rolando'. Veja a seção 6.1.	Ajuste o limiar de contorno do NMJ. Veja a seção 6.2.
Parâmetros relacionados ao comprimento do NMJ (Representado pela linha esqueleto azul na imagem dos resultados)	Linha de esqueleto azul ou se estende além ou não está presente ao longo de todo o terminal sináptico.	Figura 2C-D	Ajuste o valor 'Raio da Bola Rolando'. Veja a seção 6.1.	Ajuste o limiar de contorno do NMJ. Veja a seção 6.2.
Puncta brp-positivo (Representado por pontos na imagem de resultados)	Muitas zonas ativas são detectadas.	Figura 2E-E'	Diminua o valor 'Encontrar tolerância máxima ao ruído'. Veja a seção 6.5.
Puncta brp-positivo (Representado por pontos na imagem de resultados)	Zonas ativas são perdidas pela análise.	Figura 2G-G'	Aumente o valor 'Encontrar tolerância máxima ao ruído'. Veja a seção 6.5.	Diminua o limiar inferior de Brp-puncta. Veja a seção 6.6.
Puncta brp-positivo (Representado por pontos na imagem de resultados)	Artefatos de zona ativa são detectados fora do terminal sináptico.	Figura 2F	Ajuste a seção 'Limiar de zona ativa' 6.2.	Aumente o limiar inferior de Brp-puncta. Veja a seção 6.6.
Pequenas partículas	Partículas como cristais ou poeira que fazem parte do fundo parecem ser incluídos em a segmentação.	Figura 2J	Selecione a caixa 'Remover partículas pequenas'. Veja a seção 6.3.	Determine o tamanho máximo das pequenas partículas. Veja a seção 6.3.
Segmentação bouton	Segmentação de bouton incorreta (Aplicável apenas à Drosophila NMJ Bouton Morphometrics; não usar Drosophila NMJ Morphometrics para segmentação bouton).	Figura 2H-I	Ajuste o limiar de contorno do NMJ. Veja a seção 6.1.	Determine o "tamanho mínimo de bouton". Veja a seção 6.4.

Tabela 1: Guia de solução de problemas para os diferentes tipos de erros na segmentação de imagens que podem ser produzidos pelas Macros. Esta tabela descreve diferentes tipos de erros de segmentação de imagem produzidos pelas macros. Estes podem ser facilmente detectados nas imagens dos resultados. Exemplos de cada tipo de erro são mostrados na Figura 1. Na "seção de ajustes" da tabela, as configurações que precisam ser ajustadas são destacadas, e o usuário é encaminhado para a sub-etapa crítica da seção 6, que descreve como ajustar essas configurações.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining			Dilution
Mouse anti-discs large 1	Developmental Studies Hybridoma Bank	AFFN-DLG1-4D6	1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Rabbit anti-horseradish peroxidase	Jackson IR	323-005-021	1/500
Rabbit anti-Synaptotagmin	Gift from Hugo Bellen		Jan-00
Mouse anti-Cysteine string protein	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCSP-1(ab49)	1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Mouse anti-Bruchpilot	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Jan-50
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Life technologies	A11029	1/200
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568	Life technologies	A11011	1/500
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit	ThermoFisher	Z25006
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36930
Equipment
Confocal microscope or fluorescence microscope	Leica SP5
Zeiss Axio imager
Computer	Mac or Pc
Software
FIJI