Overview
Denne videoen introduserer en metode for å visualisere og måle integriteten til C. elegans tarm lumen ved å mate ormer FITC-merket dextran. Eksempelprotokollen viser analysen som er gjort med 3,3'-diindolylmethane (DIM)-behandlede og patogenfôrede ormer.
Protocol
Denne protokollen er et utdrag fra Le et al, Måle effekten av bakterier og kjemikalier på intestinal permeabilitet av Caenorhabditis elegans,J. Vis. Exp. (2019).
- Forberedelse av NGM-plater for testing av effekten av et kjemikalie (DIM) på intestinal permeabilitet av C. elegans matet med P. aeruginosa
- Tilsett 0,5 g peptone, 0,6 g NaCl, 195 ml destillert vann, en magnetisk omrører og 6,8 g agar til en 500 ml glassflaske (NGM-agar).
- Tilsett 0,5 g peptone, 0,6 g NaCl, 195 ml destillert vann og en magnetisk omrører uten agar til en annen 500 ml glassflaske (NGM-buljong).
- Autoklaver de to flaskene (fra trinn 1.1-1.2), en tom 100 ml glassflaske og en tom 500 ml glassflaske i 15 minutter ved 121 °C. La deretter mediet som inneholder flasker avkjøles til 55 °C i vannbadet i 30 minutter. Oppbevar agarmediet i vannbadet og fjern flasken som inneholder kjøttkraft (fra trinn 1.2) for neste trinn.
- Tilsett additivkjemikalier til NGM-buljongen: 0,4 ml 1 M CaCl2,0,4 ml kolesterol i etanol (ml), 0,4 ml 1 M MgSO4 og 10 ml 1 M KPO4 (alle disse komponentene må steriliseres bortsett fra kolesterolet i etanol). Rør deretter blandingen grundig med en magnetisk omrører ved 55 °C.
- Merk den autoklavede tomme 500 ml glassflasken med dimetylsulfoksid (DMSO) og den autoklavede tomme 100 ml glassflasken med DIM.
- Overfør 50 ml NGM-kjøttkraft til dim-merket 100 ml flaske. Tilsett 500 μL 20 mM DIM-lager i flasken og bland godt.
MERK: DIM oppløses i DMSO (20 mM DIM lager). - Fjern raskt NGM-agarmediet fra vannbadet, tilsett 50 ml NGM-agarmedium i dim-merket flaske og bland grundig.
- Legg et 20 ml aliquot AV DIM-inneholdende NGM-medium i hver 90 mm x 15 mm Petri-tallerken. Omtrent fem DIM-inneholdende NGM-plater kan gjøres fra dette trinnet.
MERK: Den endelige konsentrasjonen av DIM i hver NGM-plate vil være 100 μM. - For å klargjøre den DMSO-inneholdende NGM-platen, overfør 150 ml NGM-buljong til den DMSO-merkede 500 ml flasken. Tilsett 1,5 ml DMSO i flasken og bland godt.
- Tilsett 150 ml NGM-agarmedium i den DMSO-merkede flasken og bland grundig.
- Legg et 20 ml aliquot DMSO-inneholdende NGM-medium i hver 90 mm x 15 mm Petri-tallerken. Omtrent femten DMSO-inneholdende NGM-plater kan gjøres fra dette trinnet.
MERK: Den endelige konsentrasjonen av DMSO i hver NGM-plate vil være 0,5%. - Størk platene ved romtemperatur i minst 3 timer og oppbevar dem ved 4 °C til bruk.
MERK: Protokollen kan settes på pause her. - Fjern E. coli OP50- eller P. aeruginosa PAO1-kulturen fra 4 °C kjøleskapet og virvel kulturen ordentlig før du sprer deg på NGM-platene.
- Sett 800 μL av E. coli OP50 eller P. aeruginosa PAO1 bakteriekultur på hver ferske NGM-agarplate og la platene tørke i en 20 ° C inkubator over natten.
MERK: Protokollen kan settes på pause her. For det tredje eksperimentet (figur 1),ble to DMSO-inneholdende NGM-plater belagt med levende E. coli OP50, en DMSO-inneholdende NGM-plate belagt med levende P. aeruginosa PAO1, og en DIM-inneholdende NGM-plate belagt med levende P. aeruginosa PAO1 utarbeidet.
- Behandling av bakterier eller DIM og FITC-dextran fôring
- Inkuber de alderssynkroniserte eggene ved 20 °C i 64 timer på NGM-plater supplert med levende E. coli OP50 som mat.
- Vask den alderssynkroniserte L4 larven med S-buffer og overfør dem (mer enn ca. 500 ormer) til behandlingen NGM-plater som inneholder forskjellige bakterier og kjemikalier. Inkuber dem ved 20 °C i 48 timer.
MERK: Behandlingstiden kan variere fra 24 til 72 timer, i henhold til bakteriene og kjemikaliene som brukes. Den terapeutiske eller forebyggende effekten av DIM kan også evalueres ved å forbehandle ormene med patogener og deretter behandle ormene med DIM (den terapeutiske effekten) eller ved å forbehandle ormene med DIM og deretter behandle med patogener (den forebyggende effekten). - For å klargjøre FITC-dextran-supplerte plater, bland 2 ml varmeinaktivert E. coli OP50 med 4 mg FITC-dextran. Del deretter 100 μL av FITC-dextran- og E. coli OP50-blandingen i tjue friske NGM-agarplater (60 mm x 15 mm) og la platene tørke i 1 time på en ren benk.
MERK: Den endelige konsentrasjonen av FITC-dextran i hver NGM-plate vil være 20 μg/ml. - Klargjør fem E. coli OP50-inneholdende NGM-plater uten FITC-dextran for kjøretøykontrollbehandling. Til dette formål, del 100 μL varmeinaktivert E. coli OP50 til hver ferske NGM-agarplater (60 mm x 15 mm) og la platene tørke i 1 time på en ren benk.
MERK: For hvert uavhengig eksperiment kreves femten FITC-dextran-supplerte NGM-plater og fem NGM-plater uten FITC-dextran. - Etter 48 timers behandling (fra trinn 2.2), vask ormene med S-buffer, overfør ormene til FITC-dextran supplerte plater og NGM-platene uten FITC-dextran, og inkuber platene over natten (14-15 h).
MERK: For hver behandlingsgruppe er det nødvendig med 5 replikeringer av FITC-dextran farging (eller kjøretøykontrollfôring). - Vask ormene med S-buffer og la dem krype i den ferske NGM-agarplaten i 1 time.
MERK: For hvert uavhengig eksperiment er det nødvendig med totalt 20 ferske NGM-plater. I dette trinnet kan du bruke NGM-platen supplert uten eller med E. coli OP50. - Tilsett 50 μL 4% formaldehydløsning til hver brønn av en svart 96-brønns flatbunnsplate. Overfør ca. 50 ormer fra hver NGM-plate til hver brønn for fluorescensmålinger. Etter 1 til 2 min, fjern grundig all formaldehyd fra hver brønn og tilsett 100 μL monteringsmedium for å belegge brønnene.
MERK: Formaldehydoppløsning (4 %) brukes til å immobilisere og fikse ormene. For hver behandlingsgruppe brukes 5 brønner (5 replikeringer) til bildeanalyse.
- Imaging C. elegans med Operetta Imaging System og Bestemmelse av intestinal permeabilitet ved å måle FITC-dextran fluorescens opptak
MERK: Fluorescerende stereomikroskopi kan brukes til bildeanalyse i stedet for Operetta-systemet.- Ta fluorescensbilder og mål fluorescensintensiteten ved hjelp av Operetta High-Content Imaging System og analyser bildene med Harmony-programvare.
- I Harmony-programvaren trykker du på ikonet Åpne lokket for å åpne lokket og sette platen inn i maskinen.
- Definer parameterne.
- Klikk Oppsett, velg platetypen (96-brønns corning flat-bottom) og legg til kanalene (bright-field og EGFP kanaler).
- Juster oppsettet. Gå til Oppsettvalg, og velg deretter Spor og juster parameterne (første bilde ved 1 μm, antall plan er 10, avstanden er 1 μm).
- Velg en av behandlingsbrønnene og ett fangstfelt, og trykk test for å kontrollere om bildene er tilfredsstillende i Kjør eksperiment-delen.
- Hvis bildene er tilfredsstillende, går du tilbake til Oppsett-delen og trykker tilbakestill-ikonet på slutten av skjermen. Velg deretter alle målbrønnene og et passende antall fangstfelt.
- Gå til Kjør eksperiment på nytt og skriv inn platenavnet, og trykk deretter start for å begynne behandlingen.
- For å måle intensiteten til fluorescensen, gå til bildeanalysedelen og skriv inn bildet. Finn cellen ved å velge EGFP-kanal og metode B. Juster den felles terskelen til 0,5, areal til >200 μm2, delt faktor til 3,0, individuell terskel til 0,18 og kontrast til mer enn 0,18. Deretter beregner du intensitetsegenskapene og velger gjennomsnittet som utdata. Trykk på Bruk-ikonet for å lagre oppsettet.
- Gå til Evaluering-delen for å måle intensiteten ved å hente et varmekart og en datatabell. Sett Viktig-parameteren til Celler – Gjennomsnitt for intensitetscelle EGFP – Gjennomsnitt per brønn og start evalueringen.
MERK: Protokollen kan settes på pause her. - Hvis du vil trekke ut dataene fra Operetta, klikker du Innstilling -knappen og velger Databehandling.
- Velg Skriv arkiv, og åpne deretter bla gjennom og velg filen.
- Hvis du vil merke filen, klikker du det lille + signalet i venstre hjørne, og deretter klikker du Mål og velger Platenavn.
- Merk filen, og klikk OK.
- Velg banen for å lagre filen ved å klikke Bla gjennom-signalet i den aktive banen.
- Klikk Start for å lagre datafilen.
MERK: Protokollen kan settes på pause her.
- Statistisk analyse av FITC-dextran fluorescens av C. elegans
- Importer dataene og beregn middelverdi og standardavvik (SD) ved hjelp av en statistikkprogramvare.
- Analyser den signifikante forskjellen med enveisvariasjonsanalyse (ANOVA) etterfulgt av Tukeys multisammenligningstest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1: Effekten av DIM på intestinal permeabilitet av C. elegans matet P. aeruginosa. Mikroskopi bilder av ormer fra (A) E. coli OP50 uten FITC-dextran fôring, (B) E. coli med FITC-dextran fôring, (C) P. aeruginosa PAO1 med FITC-dextran fôring, og (D) P. aeruginosa og DIM (100 μM) cotreatment med FITC-dextran fôring. Skalastang = 1 mm (hvit) og 200 μm (svart). Alderssynkroniserte L4 larver ble inkubert i 48 timer i NGM-plater frøet med levende E. coli (A, B), levende P. aeruginosa (C), levende P. aeruginosa og DIM (D). Deretter ble ormene overført til plater som inneholder FITC-dextran (B-D), bortsett fra kjøretøykontrollen (A). (E) FITC fluorescensintensitet indikerer at tarmens permeabilitet av C. elegans ble påvirket av DIM. Kolonner og feilfelt indikerer gjennomsnittlig ± SD. ***P < 0,001 for betydelig forskjell fra kjøretøykontrollen. ###P < 0,001 og ##P < 0,01 for signifikant forskjell fra FITC-dextranbehandlede ormer matet med P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5). Denne grafen er representativ for to uavhengige eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
Cholesterol | Sigma | C3045 | |
Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
Fluorescein isothiocyanate - dextran | Sigma | FD10S | |
Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N |