Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- C. elegans brukes som en eksperimentell infeksjonsmodell av tarmpatogener som forårsaker sykdom, delvis ved å forstyrre tarmbarrieren, øke dens permeabilitet. For å kvantifisere barriereintegritet etter eksponering for en bakterie eller kjemisk forbindelse av interesse, samle ormer ved å vaske dem av platene sine.
Deretter plasserer du disse ormene på agarplater med merket mat sammensatt av varme-drept E. coli blandet med FITC-dextran, et polysakkarid med høy molekylvekt og fluorescerende tag.
La ormene spise de merkede bakteriene. De med intakte tarmbarrierer vil raskt rydde maten, mens i ormer med mer gjennomtrengelige tarmer vil fluorescerende markør trenge utover organets lumen.
Overfør ormer til en formaldehydløsning for å fikse dyrene. Etter 1 til 2 minutter, erstatt formaldehyden med monteringsmedier.
Til slutt, bilde ormene ved fluorescerende mikroskopi. Merk at C. elegans intestinale granulater er autofluorescerende, så det vil være bakgrunnssignal. Men generelt indikerer mer intestinal fluorescens høyere permeabilitet.
I eksempelprotokollen vil vi analysen effekten av behandling med biomolekylet DIM på intestinal permeabilitet av ormer infisert med patogene Pseudomonas aeruginosa bakterier.
- Forbered FITC-dextran-supplerte plater ved å blande 2 milliliter varmeinaktivert E. coli med 4 milligram FITC-dextran. Tilsett 100 mikroliter av blandingen til hver av 20 ferske NGM-agarplater og la platene tørke i en time på en ren labbenk. Etter 48 timers behandling, vask ormene med S Buffer. Overfør dem til FITC-dextran-supplerte plater og til NGM-plater uten FITC-dextran og øk platene over natten.
Neste dag, vask ormene med S Buffer og la dem krype i den friske NGM-agarplaten i en time. Tilsett 50 mikroliter av 4% formaldehyd til hver brønn av en svart 96-brønns flatbunnet plate og overfør ca 50 ormer i hver brønn. Etter 1 til 2 minutter, fjern alle formaldehyd og tilsett 100 mikroliter monteringsmedium i hver brønn.
- Formaldehyd er et giftig kjemikalie og bør håndteres med forsiktighet.
