Summary
우리는 고 지 혈 증 및 당뇨병을 가진 토끼에 있는 말 초 허 혈을 유도 하기 위하여 이용 된 외과 절차를 기술 합니다. 이 수술은 환자의 말 초 동맥 질환에서 경험 하는 조건에 대 한 전 임상 모델 역할. 혈관 조 영 법은 또한 관류의 도입 된 허 혈 및 회수의 정도를 측정 하는 수단으로 서 기술 된다.
Abstract
말 초 혈관 질환은 전세계적으로 수백만 명의 환자에 게 영향을 미치는 광범위 한 임상적 문제입니다. 말 초 혈관 질환의 주요 결과는 허 혈의 발병입니다. 심한 경우에, 환자는 그들은 지속적인 통증과 사지 절단의 증가 위험을 경험 하는 중요 한 사지 허 혈을 개발할 수 있습니다. 말 초 허 혈에 대 한 현재 치료법은 혈액 흐름을 회복 시키기 위해 스 텐트 또는 죽 상 절제술을 사용한 혈관 성형 술과 같은 경 피 개입 또는 우회 수술을 포함 한다. 그러나, 이러한 치료법은 종종 혈관 질환 또는 재 협 착의 지속적인 진행에 실패 하거나 환자의 전반적인 건강 불량으로 인해 금기 된다. 말 초 허 혈을 치료 하는 유망한 잠재적인 접근법은 환자가 담보 혈관 구조를 개발할 수 있도록 치료 적 혈관 신생의 유도를 수반 한다. 이 새로 형성 된 네트워크는 영향을 받는 부 위에 관류를 복원 하 여 말 초 허 혈을 완화 한다. 말 초 허 혈에 대 한 가장 빈번 하 게 사용 되는 전 임상 모델은 대 퇴 동맥 결 찰을 통해 건강 한 토끼에서의 뒷 사지 허 혈의 생성을 활용 한다. 과거에, 그러나, 전 임상 연구의 성공과 말 초 허 혈에 대 한 치료에 관한 임상 시험의 실패 사이의 강력한 단절 되었습니다. 건강 한 동물은 전형적으로 외과 적으로 유발 된 허 혈에 반응 하 여 강력한 혈관 재생을 가지 며, 만성 말 초 허 혈을 갖는 환자의 감소 된 바소 및 재생과는 대조적 이다. 여기서, 우리는 고 지 혈 증 및 당뇨병을 포함 하는 토끼의 말 초 허 혈을 위한 최적화 된 동물 모델을 기술 한다. 이 모델은 더 높은 콜레스테롤 다이어트 모델과 비교 하 여 부수적인 형성과 혈압 회복을 감소 시켰습니다. 따라서, 모델은 말 초 혈관 질환을 동반 하는 일반적인 공동 morbidities 로부터 손상 된 혈관 신생을 가진 인간 환자와 더 나은 상관관계를 제공할 수 있다.
Introduction
말 초 동맥 질환 (PAD)은 죽 상 경 화성 플 라크 형성의 진행이 신체의 사지에서 혈관의 협 착으로 이어지는 일반적인 순환 장애입니다. 최근 당뇨병, 비만 및 비활동을 포함 한 동맥 경화 증에 대 한 위험 요소의 증가는 혈관 질환1의 보급을 증가 시키는 것으로 이어졌습니다. 현재, 그것은 추정 된다 12%-20% 60 세 이상의 일반 인구의 말 초 동맥 질환2. 말 초 동맥 질환의 주요 결과는 말 초 허 혈의 발달 이며, 가장 일반적으로 하 부 사지에서 발견 됩니다. 심한 경우에, 환자는 중요 한 사지 허 혈을 개발할 수 있습니다, 혈액의 흐름의 부족으로 인해 일정 한 통증이 있는 상태. 중요 한 사지 허 혈을 가진 환자는 진단의 1 년 안에 1 개의 사지가 있는 경우에 50%의 가능성을가지고 있습니다. 게다가, 당뇨병을 가진 환자는 혈관 형성3,4를 위한 내정간섭 뒤에 말 초 동맥 질병 그리고 나쁜 결과의 더 높은 부각이 있습니다. 말 초 허 혈에 대 한 현재 치료법은 죽 절제술 및 스 텐트 팅 또는 외과 우회와 같은 경 피 적 개입을 포함 한다. 그러나, 많은 환자에 대 한 이러한 치료는 단기 혜택을 제공 하 고 많은 주요 수술 절차에 대 한 충분 한 건강 하지 않습니다. 이 작업에서, 우리는 당뇨병 질환 상태의 맥락에서 수술 적 결 찰을 통해 토끼에서 말 초 허 혈의 발생을 통합 하는 말 초 혈관 질환을 표적화 하는 새로운 치료법을 시험 하기 위한 전 임상 동물 모델을 기술 한다.
토끼에서의 뒷 다리 허 혈 모델은 반 세기 이상5,6에 대 한 인간 연구에 폐색 성 혈관 질환 및 임상 전 구체를 위한 생리 적 모델로 사용 되 고 있다. 토끼는 종종 발목과 종 아리 근육의 개발 근육에의 한 말 초 허 혈에 대 한 연구를 위한 바람직한 종으로, 대조적으로 일반적인 큰 동물 모델은 ungulates (hooves를 가진 동물). 몇몇 최근 리뷰는 인간7,8에서 말 초 혈관 질환을 모델링 하 고이 모델 및 다른 사람의 사용을 해결 하였다. 토끼에서의 뒷 다리의 허 혈을 이용한 유사 모델은 성장 인자9,10,11,12,13의 전 임상 연구에서 사용 되었으며, 22,16,18, 20유전자 요법21,23 24일,29일,31일,32 33,34,35,3637, 38, 42,43, 44및 줄기 세포45, 46, 47, 48 ,51은 사지의 치료 적 혈관 신생을 위한 것 이다. 불행 하 게도, 이러한 성공적인 동물 연구를 따라 임상 시험 환자에 대 한 상당한 혜택을 보여주지 않았다52.
이러한 번역 실패에 대 한 이유의 한 가지 설명은 인간 환자에서 말 초 허 혈의 상태는 혈관 신생 신호에 대 한 저항성을 포함 하는 것이 하나53,54,55, 56 , 57 , 58 , 59. 몇몇 연구는 당뇨병과 고 혈당 증에서 혈관 신생 신호 전달 경로의 결점을 보여주었습니다. 당뇨병 및 고 지 혈 증은 헤 파란 황산 염 proteoglycans을 절단 하는 효소의 증가와 헤 파란 황산 염의 손실로 이어질 수 있으며, 성장 인자60 의 치료 적 혈관 형성/동정에 대 한 저항성을 위한 잠재적인 기전을 제시 한다 , 61. 따라서, 말 초 허 혈에 대 한 모델의 주요 특징은 치료가 인간 환자에 존재 하는 질환 상태의 맥락에서 평가 될 수 있도록 치료 적 저항의 양태를 포함 한다.
이 작업에서는 대 퇴 동맥의 외과 적 결 찰을 통해 말 초 허 혈의 토끼 모형을 기술 합니다. 당뇨병과 고 지 혈 증의 유도와 함께 리드 인 기간이 모델에 통합 된다. 우리는 당뇨병 없이 높은 지방 다이어트를 통합 하는 다른 모델에이 모델을 비교 하 고 당뇨병과 고 지 혈 증의 낮은 수준의 모델은 혈관 성장을 감소에 더 효과적 이었다 발견. 우리의 모델은 별도의 그룹에 의해 사용 된 발전을 결합, 말 초 혈관 질환 연구에서 일관 된 결과를 달성 하기 위해 실용적이 고 표준화 된 방법을 제공 하는 것을 목표로.
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Protocol
동물을 포함 하는 연구는 오스틴에 있는 텍사스 대학의 대학과 휴스턴 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC), 동물 관리 및 사용 검토 사무소 (ACURO)의 UTHealth 과학 센터의 승인을 수행 했다 미국 육군 연구 보호의 의료 연구 및 물질 명령 사무실, 그리고 동물 관리를 위한 NIH 지침에 따라.
1. 당뇨병과 고 지 혈 증의 유도
- 뉴질랜드 토끼 (4 ~ 6 개월)를 표준 알 팔 파 차 한 컵에서 4 일 동안 콜레스테롤 차 우 0.1%까지 전환 합니다. 1 ~ 5 일에는 표준 차 우를 사용 하 여 1:0, 3:1, 1:1, 1:3 및 0:1의 콜레스테롤 차 우 비율을 각각 사용할 수 있습니다. 0.1%의 콜레스테롤 차 우에 2 주 후, 토끼를 유도 하 여 다음 단계에 설명 된 바와 같이 alloxan 주사를 사용 하 여 당뇨병을
- 케 타 민를 사용한 토끼는 22g 카 테 터를 사용 하 여 왼쪽 귀 정 맥에 카 테 터를 도입 하 여 IV 주사를 위한 피하 주사 및 준비를 통해, 35mg/75mg/ml의 acepromazine을 사용 한다.
- 초기 혈당 수준 (BGL) 측정을 위한 귀 정 맥 카 테 터의 허브를 통해 토끼에서 혈액 방울을 모으십시오. 모든 표준 미터 사용할 수 있습니다. 토끼에 대 한 정상 포도 당 수준은 일반적으로 80 150 Mg/dl의 범위에 있다.
- 시린 지 펌프를 사용 하 여 8 분 동안 천천히이 어 카 테 터를 통해 8 mL의 부피로 생리 식 염 수로 재구성 된 100 밀리 그램/kg에서 alloxan을 주입 하십시오.
- 다음 12 시간 동안 BGL이 저 혈당을 모니터링 하기 위해 표준 미터를 사용 하 여 매시간 확인 하십시오.
- 토끼를 제한 수단은에 놓습니다.
- 2.5% lidocaine/2.5% prilocaine 크림으로 귀 마 취.
- 27G 바늘을 사용 하 여 측면 귀 정 맥에서 혈액을 채취 하 고 표준 측정기를 사용 하 여 BGL을 측정 합니다.
- 처음 7 일 동안 BGL을 하루에 두 번 측정 하십시오. BGL이 350 mg/dl에 도달 하거나 초과 하는 경우 토끼에 게 인슐린 주사를 준다.
- 수술 전날 혈관 그램 동안 크기 마커로이 식을 위한 3mm 스테인레스 스틸 공을 준비 하십시오.
- 생 검 펀치를 사용 하 여 큰 시트에서 10 mm 원형 조각을 절단 합니다.
- 투명 실리콘 실 란 트를 사용 하 여 시트의 중앙에 공을 마운트합니다.
- 완전히 밀폐 제와 공을 커버. 최소 24 시간 동안 실 란 트를 치료할 수 있습니다.
- 볼을 열린 2 인치 x 3 인치 저밀도 폴 리 에틸렌 봉지에 넣고 멸 균 백에 넣고 에틸렌 옥 사이드 가스로 소독 하십시오.
2. 수술 용 토끼의 준비
- 토끼를 피하 주사를 통해 20 ~ 40 밀리 그램/kg 케 타 민 및 midazolam 2mg/kg을 사용 하 여 마 취 시켰다. 토끼를 아이 소 루 레인 (일반적으로 2%)에 1.5%로 놓습니다. 마스크를 사용 하 여 초기 진정 작용을 통해. 3 밀리 그램/kg의 근육 내 주사를 통해 마 취를 유지 하기 위해 alfaxalone의 주사를 제공 하십시오.
- 일단 마 취, 마스크를 제거 하 고 수 갑 기관 관을 삽입, 기도에 넣고 호흡기에 연결. 아이 소 루 레인의 1.5%를 계속 해 서 관리 한다.
- 기저 화학 패널에 대 한 양쪽 귀에서 중앙 동맥에서 혈액을 수집.
- 귀 정 맥 카 테 터 22 G을 옆 귀 정 맥에 놓고 수술 과정을 통해 간결한 링거 용액을 떨어 뜨 리 세요. 대안적으로, 통상의 식 염 수 (0.9% 염화 나트륨)가 사용 된다.
- 반대쪽 귀에 있는 횡 정 맥을 사용 하 여 정 맥에 카 테 터를 놓고 alfaxalone 6 밀리 그램/kg/h로 전달 하십시오. 점차적으로 8 mg/kg/h로 alfaxalone 증가 하는 동안 아이 소 루 란을 준비 기간 동안 0.6%로 감소 시킵니다.
- 통증과 감염의 위험을 제한 하기 위해, 부 프레 노르 핀 (0.01 밀리 그램/kg) 및 엔로 플 록 사신 (5mg/kg)을 사용 하 여 25 G의 바늘로 피하 주사를 투여 한다.
- 목, 오른쪽 및 왼쪽 안쪽 허벅지에 머리를 손질 하 고 다시 클리퍼 (#40 블레이드)를 사용 하 여. 접지 패드와의 접촉을 유지 하기 위해 뒤쪽에서 머리카락이 제거 됩니다.
- 각 뒷 다리에 혈압 커 프를 놓고 초기 혈압을 측정 합니다. 단지 측면 표면에 호크 위의 프로브와 무릎 아래에 팔목을 배치 합니다.
- 그 뒤에 수술 테이블에 토끼를 배치 하 고 스크럽 및 수술 부위를 드 레이프. 이것은 대 퇴 동맥 접근을 위한 경 동맥 접근을 위한 목 및 안쪽 오른쪽 허벅지를 포함 합니다. 2%의 클 로르 헥 사 딘과 70% 에틸 알콜을 교대로 반복 하 여 살 균 스크럽을 수행 합니다. 이를 세 번 반복한 다음 2%의 클 로르 헥 딘 용액으로 최종 스프레이를 바릅니다.
- 3mm의 스테인리스 스틸 볼을 저 농도의 폴 리 에테르 티 엔 백 내부에 살 균 하 여 허벅지 윗부분 근처의 오른쪽 (scrubbed) 다리 위에 놓고 혈관 그램 측정 시 크기 기준으로 사용할 수 있습니다. 수술 시간까지 다리 위에 무 균 드 레이프를 놓습니다. 첫 번째 혈관 그램 동안 멸 균 비닐 봉지 안에 공을 남겨 주세요.
3. 혈관 조 영 법
- 오른쪽 일반적인 경 동맥을 노출
- #15 잎을 가진 메스를 사용 하 여 기관에 그냥 횡 절 개를 4 ~ 5cm 길게 하십시오.
- 경 동맥을 노출 하 고 작은 Weitlaner 견인 기를 사용 하 여 절 개를 개방 하는 데 무딘 해 부를 사용 합니다. 경 동맥 정 맥 및 미주 신경에서 동맥을 조심 스럽게 분리 합니다. 전형적으로 곡선 메 젠 바 움가 위 및 곡선형 모기 객 혈은 무딘 해 부에 사용 됩니다. 신경에서 경 동맥을 완전히 분리 하 고 동맥을 리 게이트 하 여 합자를 만드는 정 맥을 확인 하십시오.
- 노출 된 동맥의 근 위 및 말단 말단에 4-0 실크 봉합 사를 사용 하 여 합자를 배치 하십시오. 외과 의사의 매듭 뒤에 4 개의 정사각형 매듭으로 경 동맥 말단을 묶어. 근 위 끝에서 ligaloop을 사용 하 여 필요에 따라 조여 주거나 느슨하게 할 수 있습니다. 노출 된 동맥의 근 위 단 부에 놓이는 ligaloop의 사용은 인트로 듀 서와 카 테 터를 확보 하는 것을 도울 수 있습니다.
- IV를 통해 헤 파 린의 500 IU를 관리 하십시오. 노출 된 경 동맥을 따라 약 0.5 mL의 1% lidocaine를 사용 하 여 혈관을 팽창 시킵니다. 1 개의 처리는 일반적으로 충분 합니다, 그러나 필요에 따라 반복 될 수 있습니다. 메스 또는 아이리스가 위를 사용 하 여 경 동맥을 통해 약 반 방법을 자른 다음 4 인치 와이어 삽입 도구를 동맥에 놓습니다.
- 0.014 인치 x 185 cm 가이드 와이어를 삽입 도구를 통과 하 여, 하강 하는 대동맥의 장 골 문장에서 대동맥으로 이송 합니다. 삽입 도구를 제거 하 고 3 층 피그 테일 혈관 그래픽 카 테 터를 와이어 위에 삽입 합니다.
- 하강 하는 대동맥의 장 골 문장에서 대동맥 부 위에 2 cm 근 위부로 떠 꺼 머리 카 테 터를 전진.
- 카 테 터의 끝을 일곱 번째 요 추와 첫 번째 천 골 척추 사이에 위치 시킵니다. 2 – 4 mL의 조 영제를 수동으로 주입 하 여 카 테 터의 위치를 테스트 합니다.
- 혈관 확장을 높이기 위해 카 테 터를 통해 100 μ g의 글 리세 린 내 동맥 내 주사를 관리 합니다.
- 카 테 터를 통해 토끼에 게 lidocaine 1%의 0.8 mL를 투여 하 여 혈관의 그램 동안 혈관 확장을 돕습니다. 인젝터 용 튜브를 카 테 터에 부착 하 고 라인의 기포를 제거 합니다. 카 테 터를 통해 자동 혈관 그래픽 인젝터를 사용 하 여 8-9 mL의 콘트라스트 미디어를 주입 합니다.
- 혈관 조 영 법을 사용 하 여 뒷 다리의 연속 이미지를 기록 합니다.
- 총 8-9 mL의 3 mL/초에서 대비를 주입 하도록 파워 인젝터를 설정 합니다. 초당 6 프레임에서 디지털 뺄셈 혈관 조 영 술을 수행 합니다.
- 생성 된 시리얼 이미지를 선택 하 고 약-40% 설정을 사용 하 여 각 혈관 그램의 사진을 변경 하 여 뼈의 모양을 최소화 하 고 대조를 통해 혈관 관류의 완전 한 그림을 캡처합니다. 대 퇴 동맥 결 찰/절제 후의 혈관 흐름의 예 혈관 그램은 도 1에 나타나 있다.
4. 대 퇴 동맥의 분리
- 메스 (#15 블레이드)를 사용 하 여 오른쪽 대 퇴 동맥을 통해 피부에 세로 절 개를 만듭니다. 절 개 부는 사 타 구니 인 대에서 inferiorly 확장 하는 것을 확인 하는 것은 단지 슬 골 (약 6cm)에 근 위 지역에서 끝나는.
- 구부러진 메 첸 바 움가 위 또는 구부러진 모기 객 혈이 있는 무딘 해 부를 사용 하 여 대 퇴 동맥을 노출 시킵니다.
- 열 절 개를 유지 하기 위해 Weitlaner 견인 기를 사용 하십시오.
- Lidocaine 1%의 0.5 mL를 추가 하 여 신경 자극을 줄이고 혈관 확장을 촉진 합니다.
- 열 등 상 복 부, 깊은 대 퇴, 횡 방향 우회 및 표면 상 복 부가 동맥을 포함 하 여 대 퇴 동맥의 모든 지점과 함께 대 퇴 동맥의 전체 길이를 확보 하기 위해 조직의 둔 부를 계속 합니다 (그림 2a) .
- 외부 장 골 동맥 뿐만 아니라 슬와 및 사 골 동맥을 따라 더 해를 분해 한다 (도 2a). 조직 손상 으로부터 보호 하기 위해 정기적으로 염 수로 부위를 적셔 줍니다. 무딘 해 부는 대 퇴 홈을 따라 수행 되는 경우 (근육 사이) 근육을 절단 할 필요가 없다.
- 도 2b, C에 도시 된 바와 같이 정 맥과 신경 으로부터 동맥을 조심 스럽게 분리 한다. 동맥을 절단 하는 그들 사이 충분 한 공간을 가진 두 개의 관계를 배치 하 여 4.0 실크 봉합 사로 다이어그램에 의해 표시 된 동맥을 ligate. 이 관계는 외과 의사의 매듭 뒤에 4 개의 정사각형 매듭으로 수행 됩니다.
- 작은 멧 젠 바 움가 위를 사용 하 여 결 찰 된 동맥의 두 관계를 절단 합니다. 외부 장 골 동맥의 지점으로 그 근 위 원점 으로부터 대 퇴 동맥을 소비 하는 지점으로 bifurcates, 슬와 동맥을 형성 하 게 된다.
5. 반복 혈관 조 영 법
- 4-0 실크 봉합 사를 사용 하 여 3 mm 스테인레스 스틸 볼을 사각형 근육의 윗부분에 부착 합니다. 제자리에 있는 후에 공을 통해 피부를 당깁니다.
- 혈관 확장을 높이기 위해 카 테 터를 통해 100 μ g의 글 리세 린 내 동맥 내 주사를 관리 합니다.
- 필요 하다 면, 카 테 터를 통해 토끼에 게 lidocaine 1%의 또 다른 0.8 mL를 투여 하 여 혈관 내에서 혈관 확장을 돕습니다.
- 자동 혈관 그래픽 인젝터를 사용 하 여 8-9 mL의 콘트라스트 미디어를 주입 합니다.
- 3.9 단계에서 설명한 바와 같이 혈관 조 영 술을 수행 한다.
6. 부상 폐쇄 및 회복
- 오른쪽 동맥에서 카 테 터를 제거 합니다. 이미 동맥 주위에 위치 하 고 있는 4-0 실크 봉합 사를 사용 하 여 동맥을 묶습니다.
- 두 상처가 닫힌 봉합. 연속 봉합 사 패턴의 4-0 폴 리 옥 시 원 또는 3-0 polyglactin 910을 사용 하 여 근육 및 subcuticular 레이어를 닫습니다 ( 재료 표참조). 4-0 폴 리 옥 시 에틸렌 또는 4-0 polyglactin 910를 사용 하 여 피부를 닫고 역방향 절단 바늘에 ( 재료 표참조) 묻혀 있는 연속 subcuticular 봉합 사 패턴.
참고: 가능한 경우, 다이 옥 타 원 모두에 대해 바람직하다. - 25 G 바늘로 주사기를 사용 하 여 절 개에 가까운 0.25% bupivacaine의 피 내 주사를 관리 하십시오. 바늘을 삽입 하 고 바늘을 다시 당기는 동안 0.5 mL를 주사 하십시오. 목에 절 개 (목에 두 개의 주사) 및 다리에 절 개에 대 한 상처의 측면 당 두 개의 주사에 대 한 상처의 측면 당 하나의 주사를 제공 (다리에 4 개의 주사; 총 여섯 주사). 주입 된 총 부피는 3ml(0.5 mL x 6 주사) 이다.
- 0.12 밀리 그램/kg에 멜 록 시 캄 및 서방 형 부 프레 노르 핀 0.5의 피하 주사를 투여 한다.
- 마 취에서 회복 토끼를 모니터링 합니다. 토끼는 마 취에서 깨어났을 때 자동으로 삼키기 시작 합니다. 삼 킴 반응이 일어나면 기관 내 튜브를 제거 하십시오. 토끼가 심혈 관 기능과 체온을 유지할 수 있을 때까지 가까운 모니터링과 열 지원을 제공 합니다. 그것은 통을 할 수 있게 되 면 그 인클로저에 토끼를 돌려줍니다.
- 토끼가 수술 후 차 우를 용납 하지 않는 경우에 피하 식 염 액과 함께 중요 한 배려 규정식의 신선한 야채 및/또는 주사기 먹이를 사용 합니다. 양배추, 브로콜리, 콜 리 플라워, 당근 등 제철 채소를 사용할 수 있습니다. 야채를 조각 하 고 함께 혼합 하 여 토끼가 먹기로 돌아가는 것을 돕습니다.
7. 모니터링
- 2.8 단계에서 설명한 바와 같이 양 다리에 혈압을 얻기 위해 2 주마다 토끼를 마 취 시켰다. 혈액 화학 분석에 사용 하기 위해 귀의 중앙 동맥에서 혈액을 수확 합니다. 양자 택일로, 정 맥 또는 두 부 정 맥에서 혈액을 취할. 각 시점에서 약 2 mL를 복용 하십시오. 분석을 위해 표준 혈액 화학 패널을 사용 합니다. 필요한 경우 저밀도 지 단백질 (LDL), 고밀도 지 단백질 (HDL) 또는 헤모글로빈 A1c (HbA1c)에 대 한 테스트를 추가 합니다.
- BGL 측정을 위해 매우 적은 양의 혈액을 섭취 하십시오.
8. 치료
- 치료, 담 체 및 가교 링커로 10 개의 주사기를 준비 합니다. 100 μ l의 칼슘 설 페이트 슬러리를 사용 하기 직전에 각각의 주사기를 채운 다음, 성장 인자 또는 알 긴 산 나트륨과 함께 2% 소 듐 알지 네이트의 100 μ l를 주사기의 팁에 가장 근접 하 게 한다.
- 다음을 준비 하기 전에 근육에 준비 한 주사를 관리. 이는 알 긴 산이 주사기에서 황산 칼슘과 상호작용 하는 시간을 감소 시킨다. 허벅지에 대 퇴 동맥의 양쪽을 따라 고르게 주사를 공간. 균일 한 주사를 달성 하기 위해, 다른 연구19에 기술 된 바와 같이, 주입을 안내 하는 구멍이 있는 실리콘 시트를 생성 한다. 이것은 시판 되는 실리콘 시트에 구멍을 만들기 위해 생 검 펀치를 사용 하 여 쉽게 준비할 수 있습니다.
9. 종점 혈관 조 영 술, 안락사, 관류 고정 및 조직 수확
- 종점 날짜에서 3 단계에서 설명한 바와 같이 혈관 조 영 법을 수행 하 되, 접근을 위해 왼쪽 경 동맥을 사용 한다.
- 혈관 조 영 술 후, 동물을 네 롭 시 테이블로 옮기고, 뒷 사지 조직을 보존 하기 위해 관류 고정을 수행 합니다.
- 아이 소 루 레인을 3%-4%로 증가 시키고 마 취를 충분히 깊이 확인 하기 위해 발가락 핀치를 수행 합니다.
- 정 맥의 헤 파 린 1000-2000 IU를 관리 하십시오.
- 흉 곽의 중간 선을 따라 절 개를 만들고 #20 블레이드가 있는 메스를 사용 하 여 다이어 프 램의 길이를 확장 합니다.
- 리브 케이지를 노출 시킨 후 리브 커터를 사용 하 여 중간 선 왼쪽의 리브를 자릅니다. 심 박수를 사용 하 여 심장을 노출 시킵니다.
- 내부 직경이 1/8 인치이 고 끝에 18G 바늘이 있는 출력 튜브가 있는 펌프를 설정 합니다. 식 염 액으로 라인을 미리 로드 하 고 관류를 위한 별도의 용기에서 제조 된 염 분 및 포 르 말린 적어도 600 mL을 갖는다.
- 심장의 꼭대기를 통해 좌 심 실로 펌프에 연결 된 18 G 바늘을 삽입 하십시오. 다른 18 G 바늘 (아무것도 첨부 되지 않음)을 우 아 트리 움에 삽입 하 고 혈액이 네 롭 테이블의 하향 구배에 흘러 들어갈 수 있게 하십시오.
- 관류 펌프를 사용 하 여 심장에 생리 식 염 수의 약 500 mL의 흐름을 제어 합니다. 유량 110 mL/min으로 펌프 설정을 사용 하십시오.
- 심장에서 나오는 유체가 맑은 되 면, 식 염 수 저장소에서 튜브를 10% 포 르 말린 용액으로 채워진 하나에 옮깁니다. 관류가 제대로 작동 하는 경우 경련은 네 사지 모두에서 발생 합니다. 포 르 말린 용액을 좌 심 실에 약 500 mL의 펌프.
- 펌프를 끄고 심장에서 바늘을 제거 하십시오.
- #20 잎을 가진 메스로 엉덩이 관절 주위를 절단 하 여 엉덩이에서 양쪽 뒷 다리를 제거 하십시오. 작은 늑 골 절단기를 사용 하 여 사지를 제거 합니다. 비 허 혈 성 사지를 대조 군으로 사용 한다.
- 사지를 4 ° c에서 24 시간 동안 포 르 말린에 저장 하 고 4°c에서 70% 에탄올에 저장 하였다.
- 조직학 분석을 위해 사지에서 여러 생 검을 복용 하십시오. 우리는 두 팔 다리에 허벅지와 송아지를 가로질러 지역에서 찍은 8 개의 6mm 생 검을 사용 했습니다.
참고: 발목 혈압 측정 및 혈관 조 영 술은 혈 류의 회복을 측정 하는 데 가장 일반적으로 사용 되는 방법 이지만, 다른 방법은 도플러 초음파, 레이저 도플러 이미징, 적외선을 포함 한 동물의 회복을 추적 하는 데 사용할 수 있습니다. 서 모그래피 62, 마이크로 스피어는관류 63,64, 전산화 단층 촬영 및 자기 공명 영상 (MRI)65을 결정 했습니다.
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Representative Results
당뇨병의 유도 및 0.1% 콜레스테롤 다이어트의 개시에 따라, 당뇨병 및 콜레스테롤 식이와 함께 토끼에 대 한 총 콜레스테롤은 123.3 ± 35.1 Mg/dl (수 컷 토끼)의 평균 전체 시간 지점과 토끼 였다. 이들 토끼에 대 한 BGL 레벨은 248.3 ± 50.4 Mg/dl (수 컷 토끼) 이었다. 일반적인 토끼의 혈액 화학 및 다리 혈압 비에 대 한 시간 과정은 더 높은 콜레스테롤 다이어트 (1% 콜레스테롤) 아래 토끼에 비해 그림 3 에 나타나 있다. 비 당뇨병 동물에서, 심지어 높은 콜레스테롤, 우리는 최종 시점에서 혈관 그램에서 허 혈 성 사지 및 혈관에서 혈압의 증가 회복 했다 발견 (그림 3). 높은 콜레스테롤/지방 규정식에 있는 동물 또한 지 단백질 A의 증가 수준을 보였다, 간장에 스트레스를 제안. 따라서, 콜레스테롤의 저수준을 가진 당뇨병은 연구 종점에 더 손상 한 관류를 이끌어 냅니다. 조직 학적으로, 일부 위치에서 부 종 및 허 혈 성 손상과 일치 근육 구조의 변화가 그림 4. 경우에 따라서는 허 혈에의 한 근육 섬유의 변화/손상을 관찰할 수 있다. 이는 쥐의 일부 뒷 다리 허 혈 모델에서 관찰 된 것과 같이 조직 학적 분석에서 근육 섬유의 손실이 나 파괴로 관찰 될 수 있다. 그러나, 치료는 조직 처리의 조직학 유물에서 이러한 변화를 구별 하기 위해 필요 하다. PECAM 및 α Sma에 대 한 면역 염색은 조직 절편 내의 혈관 및 큰 혈관의 수를 동정 하는데 사용 될 수 있다 (도 4). 전반적으로, 낮은 수준의 콜레스테롤 다이어트와 당뇨병을 사용 하 여 모델 당뇨병 없이 높은 콜레스테롤 다이어트 모델에 대 한 혈압과 혈관의 반복 적자를 생산.
그림 1: 당뇨병 및 비 당뇨병 토끼 수술 전, 후 수술 후 및 대 퇴 동맥 결 찰 및 절제 후 70 일 동안 회복 된 후의 뒷 사지에 대 한 혈관 내 그램. (A) 허 혈 성 사지의 혈관 (왼쪽) 및 반대편 조절 사지 (오른쪽). (B) 결 찰 부 위에서 허 혈 성 사지의 확대 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도 2: 대 퇴 동맥 결 찰 및 절제를 통해 토끼의 허 혈 후의 뒷 다리의 유도. (A) 토끼 뒷 다리의 혈관 해부학에 대 한 그림. 동맥을 ligate에 표시 된 모든 지점에 넥타이를 놓습니다. 수정 및 사용 권한71. (B) 결 찰 하기 전에 대 퇴 동맥에 대 한 절단을 보여주는 외과 분야. (C) 뒷 다리 허 혈을 유도 하는 장소에서의 대 퇴 동맥. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도 3: 전형적인 혈압과 뒷 다리를 가진 토끼에 대 한 혈액 화학은 모델의 과정을 통해 허 혈. 당뇨/MC 그룹은 당뇨병을 유발 하 고 0.1%의 콜레스테롤 식이 요법을 받았다. 비 당뇨/HC 군은 1% 콜레스테롤 식이를 받았다. BGL = 혈당 수준. TC = 총 콜레스테롤. 리 파 = 단백. BP = 허 혈 성 및 비 허 혈 성 사지 사이의 혈압 비. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도 4: 대 퇴 동맥 결 찰 후 70 일 후의 당뇨병 토끼에서의 뒷 다리 근육의 조직 학적 분석. H & E 염색 뿐만 아니라 내 피 마커, PECAM 및 혈관 평활 근 세포 마커 α Sma에 대 한 면역 조직 염색을 수행 하였다. 조직 샘플은 허 혈 성 사지 및 비 허 혈 성 반대편 조절 사지 로부터 생 검을 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리는 토끼에서 당뇨병과 고 지 혈 증으로 뒷 다리 허 혈을 유도 하기 위한 전 임상 모델을 제시 했습니다. 많은 연구에서, 토끼에서 뒷 다리 허 혈을 만드는 데 사용 되는 기술에 모호함이 있습니다. 생쥐에서, 허 혈의 중증도 및 회복은 국 소 빈 혈을 유도 하는데 사용 되는 결 찰 및 기술 위치에 크게 의존 한다. 이 작업에서 제시 된 기술의 중요성은 당뇨병 동물에서 8 주 후에 완전히 회복 되지 않는 허 혈의 일관 된 유도를 허용 한다는 것입니다. 특히, 동물이 더 높은 콜레스테롤과 지방 규정식을 주어질 때, 그들은 사지 혈압 비율의 기준선 수준 근처에 복구할 수 있었습니다. 또한, 높은 지방 다이어트에 동물 간 손상을 제안 하는 간 효소에 변경 했다. 따라서, 더 낮은 수준의 콜레스테롤/지방으로 당뇨병 모델은 사지에서 만성 허 혈의 보다 일관 되 고 관련성 있는 모델 인 것으로 보인다.
당뇨병의 유도, 혈관 조 영 술, 대 퇴 동맥의 외과 결 찰 및 치료 적용을 포함 하 여이 모델 내에서 네 가지 필수 단계를 강조 할 수 있습니다. 이러한 단계 중, 당뇨병의 유도는 가장 중요 한 단계 중 하나 이며 각 실험실에 대 한 추가 최적화가 필요할 수 있습니다. Alloxan 주입의 비율은 토끼를 위한 alloxan에 의해 당뇨병의 유도의 독성 그리고 효력을 바꾸는 중요 한 요인입니다. 너무 빨리 주입 될 때, alloxan은 토끼에 있는 BGL 및 죽음에 있는 불안정을 일으켰습니다. 이것은 때로는 포도 당 용액의 주사를 통해 해결 되지 않는 저 혈당으로 관찰 될 수 있다 또는 다른 경우에 매우 높은 BGL. 너무 천천히 주사 하는 경우 토끼는 종종 당뇨병이 될 실패. 이 매개 변수는 다른 소스에서 토끼에 최적화 할 필요가 있을 수 있습니다. 토끼는 일반적으로 1-3 h를 위한 고 혈당이 될 것입니다, 그러나 BGL는 그 때 하락 하기 시작할 것입니다. 따라서, 일반적으로 인슐린은 당뇨병 유도의 날에 관리 되지 않습니다. 그러나 BGL이 처음 24 시간 내에 100 Mg/dl 이하로 떨어지면, 5%의 덱 스트로 스 용액을 피하 또는 10%의 포도 당 용액 (전형적으로 하룻밤 동안)으로 변경 하 여 10.0 mL를 주입 하 여 증가 시킬 수 있다. 인슐린이 투여 될 때마다 여분의 BGL 시험은 포도 당 수치가 너무 낮게 떨어 지지 않도록 하기 위해 수행 된다. 인슐린 반응성은 종종 토끼 마다 다릅니다. 따라서, 개별 투약 식이요법은 토끼가 인슐린에 반응 하는 방법에 근거를 둔 BGL를 정상화 하기 위하여 이용 됩니다. 당뇨병은 일반적으로 alloxan 주입 후에 2-3 일 후에 유도 됩니다.
말 초 혈관 질환 및 사지 허 혈의 전 임상 모델로 서, 제시 된 모델은 몇 가지 잠재적 한계를가지고 있다. Alloxan을 가진 당뇨병의 유도는 유형 I 당뇨병의 급속 한 발달에 지도 합니다. 이것은 인간 환자에서 가장 널리 퍼진 유형 II 당뇨병의 만성 발달과 대조 됩니다. 더욱이, 허 혈은 혈관 질환 및 죽 상 경 화성 플 라크의 만성 발달에 기인 하는 것이 아니라 외과 적 결 찰 때문에 심하게 개발 된다. 토끼 사용의 근본적인 제한은 동물 모델로 서의 취약성입니다. 상기 동물은 당뇨병과 병용 하 여 제한 된 양의 고 지 혈 증을 용인 하 고 동물 다이를 갖지 않고 최대 질환 량을 최적화 하 여이 프로토콜을 만드는 주요한 목표 였다. 우리 그룹은 말 초 허 혈 환자에 게 혈관 신생 성장 인자에 대 한 치료 내성을 개발 하 고이는 허 혈66에 대 한 성장 인자 기반 치료제의 실패에 중요 한 역할을 할 수 있다고 가설 했다. 이를 위해 우리는 세포 표면 proteoglycans의 손실과 동물 및 인간 조직 샘플의 heparanase 증가를 보이고 있다55,58,67,68,69,70 . 여기에 설명 된 토끼 모델은 성장 인자 저항성을 보여주는 지 여부를 알 수 있지만, 고 지 혈 증 모델과 비교 하 여 장기간의 허 혈 성 당뇨병 및 중간 혈 증 모델을 갖는 것으로 관찰 하는 것이 좋습니다 혈관 신생 과정에는 약간의 적자가 있습니다.
모델에 치료를 포함 시키기 위해, 급성 치유 단계가 개입 없이 발생할 수 있도록 허 혈의 유도 후 회복 기간을 갖는 것이 중요 하다. 치료가이 시간 동안 주어 지 면, 반응은 말 초 혈관 질병을 특징 짓는 만성 허 혈 보다는 오히려 급성 허 혈에 대 한 반응을 강화 하는 것에 더 관련성이 있을 것 이다. 이러한 모델은 외상 또는 혈전 증에서 급성 허 혈 성 손상과 관련이 있을 수 있지만, 만성 허 혈과의 양호한 상관관계를 제공 하지 않을 것 이다. 건강 한 동물에서 허 혈의 임상 전 모델에서 긍정적 인 결과와 임상적 시험의 결과 사이에 가난한 상관관계를 감안할 때, 당뇨병 또는 혈관 재생을 감소 시키는 다른 요인의 포함은 미래 치료의 생성을 위한 인간에서 사지 허 혈을 탈환.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자 들은 국방부의 의회 의원 지향 연구 프로그램 (DOD CDMRP)을 통해 기금을 기꺼이 인정 한다. W81XWH-16-1-0582)를 ABB 및 RS에 제공 합니다. 저자는 또한 미국 심장 협회 (17IRG33410888), DOD CDMRP (W81XWH-16-1-0580) 및 국립 보건 연구소 (1R21EB024147-11A1; 1R01HL141761-01)를 통해 ABB에 게 자금을 인정 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride | Henry Schein Medical | 1537468 / 1531434 | 250 mL bag / 1000 mL irrigation btl |
| 1 mL Syringe | VWR | BD309628 | |
| 10 mL Syringe | VWR | BD309695 | |
| 10% Formalin | Fisher-Scientific | 23-245684 | |
| 18G Needle | VWR | 89219-294 | |
| 20G Needle | VWR | 89219-340 | |
| 25G Needle | VWR | 89219-290 | |
| 27G Needle | VWR | 89219-288 | |
| 5 mL Syringe | VWR | BD309646 | |
| 5% Dextrose | Patterson Veterinary | 07-800-9689 | |
| Acepromazine | Patterson Veterinary | VEDC207 | |
| Alfaxalone | Patterson Veterinary | 07-891-6051 | |
| Alginate | Sigma-Aldrich | PHR1471-1G | |
| Alloxan Monohydrate | Sigma-Aldrich | A7413 | |
| Angiography Equipment | Toshiba | Infinix-i | |
| Angiography Injector | Medrad | ||
| Anti-Mouse Ab Alexa 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | Secondary Antibody for IHC |
| Anti-Rabbit Ab Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | Secondary Antibody for IHC |
| a-SMA Antibody | Abcam | ab5694 | Primary Antibody for IHC |
| Baytril | Bayer Animal Health | 724089904201 | Enrofloxacin |
| Blood Chemistry Panel | IDEXX | 2616 | Rabbit Panel |
| Blood Pressure Cuff | WelchAllyn | Flexiport Disposable BP Cuff-infant size 7 | |
| Blood Pressure Monitor | Vmed Technology | Vmed Vet-Dop2 | |
| Bupivacaine | Henry Schein Medical | 6023287 | |
| Buprenorphine | Patterson Veterinary | 42023017905 | |
| Buprenorphine SR | ZooPharm | ||
| Calcium Sulfate | CB Minerals | Food and Pharmaceutical Grade USP and FCC | |
| Chlorhexidine Scrub | Patterson Veterinary | 07-888-4598 | |
| Chloroform | Fisher-Scientific | C298-4 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8503 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Ear Vein Catheter | Patterson Veterinary | SR-OX165 | Surflo IV catheters |
| Endotracheal tube | Patterson Veterinary | Sheridan Brand, Depends on Rabbit Size | |
| Glucometer | Amazon | B001A67WH2 | Accu-Chek Aviva |
| Glucometer Test Strips | McKesson Medical-Surgical | 788222 | Accu-Chek Aviva Plus |
| Guidewire | Boston Scientific | 39122-01 | |
| Hair Clippers | Amazon | B000CQZI3Q | Oster #40 blade |
| Heating Pad | Cincinnati Subzero | 273 | |
| Heating Pad Pump | Gaymar | Gaymar T/Pump | |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13009-12 | Curved Mosquito Hemostat |
| Heparin | Patterson Veterinary | ||
| Insertion Tool | Merit Medical Systems | MAP550 | metal wire insertion tool |
| Insulin | HPB Pharmacy | Novalin R & Novalin N | |
| Insulin Syringes | McKesson Medical-Surgical | 942674 | |
| Introducer | Cook Medical | G28954 | 3F Check Flo Performer Introducer |
| Isoflurane | Henry Schein Medical | 1100734 | |
| Ketamine | Patterson Veterinary | 856440301 | |
| Lactated Ringers | McKesson Medical-Surgical | 186662 | |
| Lidocaine | McKesson Medical-Surgical | 239936 | |
| Lidocaine/Prilocaine cream | McKesson Medical-Surgical | 761240 | |
| Ligaloop | V. Mueller | CH117 / CH116 | White Mini / Yellow Mini |
| Mazola Corn Oil | Amazon | B0049IIVCI | |
| Medrad Syringe | McKesson Medical-Surgical | 346920 | 150 mL |
| Meloxicam | Patterson Veterinary | ||
| Metal ball sutures | Ethicon-Johnson & Johnson | K891H | 4-0 silk C-1 30" |
| Metzenbaum Scissors | Fine Science Tools | 14019-13 | |
| Midazolam | Henry Schein Medical | 1215470 | |
| Nitroglycerin | McKesson Medical-Surgical | 927528 | |
| PECAM Antibody | Novus Biologicals | NB600-562 | Primary Antibody for IHC |
| Perfusion Pump | Masterflex | ||
| Pigtail Catheter | Merit Medical Systems | 1310-21-0053 | 3F pigtail |
| Polydioxanone (PDS II) suture | McKesson Medical-Surgical | 129271 | 4-0 taper RB-1 (needle comes on suture) |
| Polydioxanone (PDS II) suture | McKesson Medical-Surgical | 129031 | 4-0 reverse cutting FS-2 |
| Polyglactin 910 (Vicryl) suture | Butler | 7233-41 | 3-0 taper RB-1 |
| Polyglactin 910 (Vicryl) suture | McKesson | 104373 | 4-0 reverse cutting FS-2 |
| Rabbit Chow (Alfalfa) | LabDiet | 5321 | |
| Rabbit Restrainer | VWR | 10718-000 | |
| Rib Cutters | V. Mueller | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blade | Fine Science Tools | 10015-00 | #15 blade |
| Silk Sutures | Ethicon-Johnson & Johnson | A183H | 4-0 silk ties 18" |
| Stainless Steel Ball | McMaster-Carr | 1598K23 | 3-mm diameter |
| Surgical Drapes | Gepco | 8204S | |
| Syringe Pump | DRE Veterinary | Versaflow VF-300 | |
| Visipaque contrast media | McKesson Medical-Surgical | 509055 | |
| Weitlaner Retractor | Fine Science Tools | 17012-13 |
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