这份报告提供了一个平行板流动腔分析研究生理剪切应力下的白细胞内皮细胞相互作用的视像描划。调查的内皮细胞(E) – 选择素和白细胞E -选择素配体触发白细胞在血管内皮细胞表面滚动的作用,这种方法尤其有用。
E -选择是对微血管内皮细胞1型膜蛋白,有助于启动的循环白细胞,皮肤,骨骼和发炎组织的招聘。 E -选择素的表达,是构成对皮肤和骨骼的微血管和促炎性细胞因子,如IL -1α/和TNF -α,微血管发炎组织,诱导。这种外源凝集素受体介导循环白细胞,在一个特点的滚动行为结果与碳水化合物的反受体配体结合的相互作用较弱。因为这些相互作用的胶更稳定的事件和diapedesis活动,白细胞滚动活动的特征和白细胞E -选择素配体识别之前已白细胞贩运和炎症的研究和消炎疗法发展的主要目标(1-5) 。本报告的目的是提供一个视觉生理血流条件下E -选择素E -选择素配体相互作用的研究最广泛使用的技术,全面的描述。我们的实验室与哈佛皮肤病研究中心一起,用一个国家的最先进的平行平板流动腔装置伴随着数字可视化和新的录音软件,NIS元素。这项技术使我们能够粘附在屏幕上的可视化,以及记录在视频格式的滚动活动实时事件分析。细胞粘附的参数,如滚动频率,抗剪和有约束力的效率/圈养的,NIS元素的软件计算,导出到Excel电子表格和统计分析。在这里介绍的示范,我们采用的平行板流动腔调查现场人骨髓内皮细胞(HBMEC)E -选择素依赖的白细胞滚动活动。人类造血祖细胞KG1a细胞,表达高水平的E -选择素配体,被用来作为我们的白细胞模式,而一个永生HBMEC细胞株,HBMEC – 60细胞,内皮细胞模型(6)。诱导和模拟原生E -选择素的表达,在流室HBMEC – 60细胞与IL – 1激活。我们的视频演示表明,平行板流分析是一个适合学习生理E -选择素介导的白细胞滚动活动和白细胞E -选择素配体(S)的功能特性在流动腔的方法,可确定实施蛋白酶或糖苷酶消解。
平行平板流动腔的分析是一种在体外检测系统专门用于研究白细胞 – 内皮粘合剂相互作用下剪应力条件相似传授那些表面的毛细血管后微静脉。正如在我们的视觉表现描绘,我们展示了这个系统的调查E -选择素的作用的价值 – E -选择素配体介导白细胞圈养和激活微血管内皮细胞的表面上滚动。我们也揭示蛋白酶,糖苷酶和阐明E -选择素及其配体在这个系统中的作用的封闭抗体治疗中的应用。这些分析是高度重现性好,有利于形成学习E -选择素的实验依据 – E -选择素配体在体内的功能。
此外,以研究细胞与细胞因子激活的微血管内皮细胞(HBMEC或人脐静脉或皮肤微血管内皮细胞)的单分子膜的附着力,可以用纯化的重组人E -选择或作为基材的E -选择素,免疫球蛋白嵌合分子检测细胞粘附。胶粘剂等的相互作用,通过白细胞介(L -型)选择和血小板(P)的选择,也可以使用平行板流动腔技术检测。通过改变细胞单层/蛋白底物的类型,或输入的白细胞/选择,转染的细胞模型,研究人员可以研究生理剪应力条件下的这些相互作用的作用。
The authors have nothing to disclose.
该项目的筹资提供了由美国癌症协会的研究学者奖(06 – 024 – 01 – CSM的查尔斯J Dimitroff);国家机构的健康/美国国家癌症研究所资助(RO1CA118124查尔斯J. Dimitroff);和国家卫生研究所/国家关节炎,肌肉骨骼及皮肤疾病授予的研究院(P30 AR042689托马斯博士S. Kupper;布里格姆与妇女医院,马萨诸塞州波士顿)。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
FBS | SIGMA | F6178-500ML | ||
DPBS | GIBCO | 14190 | ||
0.5 M EDTA | GIBCO | 15575-038 | ||
1M HEPES | GIBCO | 15630 | ||
Parallel-Plate Flow Chamber Kit | GlycoTech | 31-001 | ||
PHD2000 Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | ||
35x10mm Tissue Culture Dish | BD FALCON | 353001 | ||
Fibronectin , from human plasma | SIGMA | 86088-83-7 F2006-2MG | ||
Interleukin-1_, Human; Recombinant | SIGMA | I9401-5UG | ||
HBSS (Hank s Buffered Saline Solution) | GIBCO | 14170 | ||
Medium 199 w/ HEPES & Glutamine | Invitrogen | 12320-039 | ||
Human Serum | Innovative Research, Inc. | IPLA-SER1 | ||
Heparin | Abraxis Pharmaceutical Products | 504011 | ||
Recombinant human fibroblast growth factor | R&D Systems | 233-FB | ||
Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140 | ||
Plastic Test tubes | BD Bioscience | 352008 | ||
Anti-human E-selectin clone BBIG-E4(5D11) | R&D Systems | BBA16 | ||
Bromelain | SIGMA | B-4882 |