このレポートでは、生理的ずり応力下で白血球の血管内皮の相互作用を研究するための平行平板フローチャンバーの分析の視覚的描写を提供します。このメソッドは、トリガーの白血球が内皮細胞の表面上を転動すること内皮(E)-セレクチンと白血球E -セレクチンリガンドの役割を調べるために特に有用である。
E -セレクチンは、皮膚、骨および炎症組織への白血球の循環の募集を開始役立つ微小血管内皮細胞上の1型膜タンパク質である。 E -セレクチンの発現は、皮膚や骨微小血管で構成的であり、炎症組織における微小血管でのような/ IL -1αとTNF -αなどの炎症性サイトカイン、、によって誘導される。このレクチン受容体が媒介する特徴的なローリング動作につながる循環白血球、上の炭水化物カウンター受容体のリガンドとの弱い結合相互作用を。これらの相互作用がより安定した接着剤のイベントや漏出の活動、白血球のローリング活動の特性評価および白血球E -セレクチンのリガンドの同定に先行するので、白血球の人身売買や炎症の研究で、抗炎症治療薬の開発(1-5)における主要な目標となっている。このレポートの目的は、生理的な血流の条件下で、E -セレクチン、E -セレクチンのリガンドの相互作用を研究するための最も広く使用されている技術の視覚的、包括的な説明を提供することです。ハーバード大学の皮膚病の研究センターと連携して当研究室では、デジタル視覚化し、新たな録音ソフトウェアを伴う最先端の平行平板フローチャンバー装置、NIS – Elementsを使用しています。この技術は、私たちは画面上の可視化だけでなく、ビデオフォーマットで記録圧延活動のためのリアルタイムで接着事象を分析することができます。このようなローリング周波数、せん断抵抗とテザリング/結合効率などの細胞接着のパラメータは、、Excelスプレッドシートにエクスポートして統計分析を受ける、NIS – Elementsシリーズはソフトウェアで計算されます。ここで紹介するデモでは、我々は生きてヒト骨髄内皮細胞(hBMEC)上のE -セレクチン依存性の白血球のローリング活動を調査するために平行平板フローチャンバーを採用。不死hBMEC細胞株、HBMEC – 60細胞は、私たちの内皮細胞のモデル(6)として使用されていたので、E -セレクチンリガンドのハイレベルを発現するヒト造血前駆KG1a細胞は、、、私たちの白血球のモデルとして使用された。フローチャンバーのネイティブE -セレクチンの発現を誘導し、シミュレートするには、HBMEC – 60細胞は、まずIL – 1で活性化した。私たちのビデオプレゼンテーションは、その平行板流れの解析は、プロテアーゼやグリコシダーゼを実装することによって確認できるフローチャンバーに生理的なE -セレクチンを介した白血球のローリング活動と白血球E -セレクチンリガンド(s)のその機能解析を研究するのに適した方法であることを示した消化。
後毛細血管細静脈の表面に付与するもの同様のせん断応力条件下での内皮接着剤の相互作用 – 平行平板フローチャンバーの分析は、白血球の勉強のために使用されるin vitroアッセイ系の専門です。白血球テザリングを媒介し、活性化微小血管内皮細胞の表面上を転動でE -セレクチンリガンド – 私たちの視覚的なプレゼンテーションでここに示すように、我々はE -セレクチンの役割を調べるためにこのシステムの価値を実証。我々はまた、プロテアーゼ、グリコシダーゼとこのシステムのE -セレクチンとそのリガンドの役割を解明するためのブロッキング抗体の治療法の適用を明らかにする。これらの解析は、再現性の高いものであり、E -セレクチン研究するための実験的基礎を形成支援 – in vivoでのE -セレクチンリガンドの機能を。
サイトカイン活性化微小血管内皮細胞(hBMECまたはヒト臍帯静脈や皮膚微小血管内皮細胞)の単層で細胞接着を研究に加えて、アッセイは、組換えヒトE -セレクチンや基板などのE -セレクチン- Igのキメラ分子を精製使用して行うことができます。細胞接着用。白血球を介して仲介他の接着剤の相互作用(L -)-セレクチンと血小板(P)-セレクチンは、平行平板フローチャンバー技術を用いてアッセイすることができます。細胞単層/タンパク質基質のまたは入力白血球/セレクチン-トランスフェクタント細胞モデルの種類を変えることにより、研究者らは生理的せん断ストレス条件下でこれらの相互作用の役割を学ぶことができます。
The authors have nothing to disclose.
健康/国立がん研究所の助成金(チャールズJ. DimitroffにRO1CA118124)の国立研究所;このプロジェクトの資金は、アメリカ癌協会の研究Scholarの賞、(チャールズJ. Dimitroff〜06 – 024 – 01 – CSM)によって提供されたと関節炎と筋骨格および皮膚疾患の助成金(;ブリガム女性病院、ボストン、マサチューセッツ博士トーマスS.クッパーへP30 AR042689)の健康/国立研究所の国立研究所。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
FBS | SIGMA | F6178-500ML | ||
DPBS | GIBCO | 14190 | ||
0.5 M EDTA | GIBCO | 15575-038 | ||
1M HEPES | GIBCO | 15630 | ||
Parallel-Plate Flow Chamber Kit | GlycoTech | 31-001 | ||
PHD2000 Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | ||
35x10mm Tissue Culture Dish | BD FALCON | 353001 | ||
Fibronectin , from human plasma | SIGMA | 86088-83-7 F2006-2MG | ||
Interleukin-1_, Human; Recombinant | SIGMA | I9401-5UG | ||
HBSS (Hank s Buffered Saline Solution) | GIBCO | 14170 | ||
Medium 199 w/ HEPES & Glutamine | Invitrogen | 12320-039 | ||
Human Serum | Innovative Research, Inc. | IPLA-SER1 | ||
Heparin | Abraxis Pharmaceutical Products | 504011 | ||
Recombinant human fibroblast growth factor | R&D Systems | 233-FB | ||
Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140 | ||
Plastic Test tubes | BD Bioscience | 352008 | ||
Anti-human E-selectin clone BBIG-E4(5D11) | R&D Systems | BBA16 | ||
Bromelain | SIGMA | B-4882 |