Summary
Dit rapport geeft een visuele voorstelling van de parallelle plaat stroom kamer analyse voor het bestuderen van leukocyten endotheliale interacties onder fysiologische shear stress. Deze methode is vooral nuttig voor het onderzoeken van de rol van het endotheel (E)-selectine en leukocyten E-selectine liganden die leiden tot leukocyten rollen op de endotheliale cellen oppervlakken.
Abstract
E-selectine is een type-1 membraaneiwit op microvasculaire endotheelcellen die helpt te starten werving van circulerende leukocyten aan huid-, bot-en ontstoken weefsels. E-selectine expressie is constitutief op de huid en bot microvaten en is induceerbaar door pro-inflammatoire cytokines, zoals IL-1α / en TNF-α, op bloedvaten in ontstoken weefsels. Dit lectine receptor bemiddelt zwakke binding interacties met koolhydraten contra-receptor liganden op circulerende leukocyten, wat resulteert in een karakteristieke rollende gedrag. Omdat deze interacties vooraf meer stabiele lijm evenementen en diapedesis activiteit, karakterisering van leukocyten rollen activiteit en identificatie van leukocyten E-selectine liganden zijn belangrijke doelstellingen in studies van leukocyt mensenhandel en ontstekingen en de ontwikkeling van anti-inflammatoire geneesmiddelen (1-5) . De bedoeling van dit rapport is om een visuele, uitgebreide beschrijving van de meest gebruikte technologie voor het bestuderen van E-selectine E-selectine ligand interacties onder fysiologische doorbloeding voorwaarden. Ons laboratorium in samenwerking met de Harvard Skin Disease Research Center maakt gebruik van een state-of-the-art parallelle plaat stroom kamer apparaat, vergezeld van digitale visualisatie en nieuwe opname software, NIS-elementen. Deze technologie stelt ons in staat om de hechting gebeurtenissen te analyseren in real time voor het scherm visualisatie en opname rollen activiteit in een video-formaat. Celadhesie parameters, zoals walsen frequentie, schuifweerstand en binding / tethering-efficiëntie, worden berekend op basis van NIS-Elements-software, geëxporteerd naar een Excel-spreadsheet en onderworpen aan statistische analyse. In de demonstratie hier gepresenteerde, hebben we in dienst van de parallelle plaat stroom kamer naar E-selectine-afhankelijke leukocyten rollen activiteit te onderzoeken op levende menselijke beenmerg endotheelcellen (hBMEC). Humane hematopoietische voorlopercellen KG1a cellen, die een hoog niveau van E-selectine ligand uit te drukken, werden gebruikt als onze leukocyten model, terwijl een onsterfelijk hBMEC cellijn, HBMEC-60 cellen, werd gebruikt als onze endotheelcellen model (6). Te induceren en native E-selectine expressie te simuleren in de stroom kamer, HBMEC-60 cellen werden voor het eerst geactiveerd met IL-1. Onze video presentatie liet zien dat parallelle plaat flow analyse is een geschikte methode voor het bestuderen van fysiologische E-selectine-gemedieerde leukocyten rollen activiteiten en dat functionele karakterisering van leukocyten E-selectine ligand (s) in de stroom kamer kan worden vastgesteld door de uitvoering van protease of glycosidase ontsluitingen.
Protocol
1. Voorbereiding van hBMEC (HBMEC-60 Cell) monolagen op Petri Gerechten voor Flow Kamer
- Coat 35 x 10mm weefselkweek gerechten met 2 ml 20μg/ml fibronectine (in PBS) overnacht bij 4 ° C of gedurende 3 uur bij 37 ° C.
- Aspireren fibronectine oplossing van gerechten en voeg 1,5 x10 5 HBMEC-60 cellen [Medium 199 met HEPES & Glutamine, 10% FBS, 10% humaan serum, 5 eenheden / ml heparine, 1ng/ml recombinant menselijk fibroblast groeifactor, 1% penicilline- streptomycine] om de schotel en laat ze groeien tot> 90% confluentie. (Dit duurt 2 dagen)
- Aspireren groei media en om up-reguleren E-selectine expressie, voeg vers medium met 50ng/mL IL-1β voor 4-6 uur. Celmonolagen zijn nu klaar voor het rollen van test. Om E-selectine functieblok neutraliserende anti-humane E-selectine Moab (kloon BBIG-E4 (5D11)) kan worden toegevoegd aan 20μg/ml voor ~ 1 uur bij 37 ° C.
2. De voorbereiding van humane hematopoietische Progenitor KG1a Cellen voor Flow Kamer
- Humane hematopoietische voorlopercellen KG1a cellen zijn gegroeid tot confluentie (1x10 6 cellen / ml) in RPMI-1640 met glutamine en 10% FBS / 1% penicilline-streptomycine en zijn direct gepipetteerd uit de fles voor gebruik in de stroom kamer test.
- Aantal cellen wordt berekend met behulp van een hemacytometer en vervolgens cellen worden opnieuw geschorst op 1 x 10 6 cellen / ml in HBSS met 10mm HEPES (H / H Buffer) en 2 mm CaCl 2
- Cellen worden opgeslagen op ijs tot gebruik in de test.
3. Voorbereiding van microscoop, Parallel-Plate Flow Kamer en spuitpomp (figuur 1)
Figuur 1. Illustratie van Parallel-Plate Flow Analysis Kamer. Omgekeerde microscoop, Harvard-spuitpomp, computer / camera en de parallelle plaat stroom kamer worden geplaatst in een optimale regeling voor een efficiënte en reproduceerbare cel analyse.
- Zet op macht en lichtbron te omgekeerde microscoop en de macht om spuitpomp en selecteer de 10X Doel van de microscoop.
- Plaats 50ml conische buis in de houder en vul aan met H / H en 2 mM CaCl 2.
- Plaats 5 ml plastic reageerbuisjes in reageerbuis houder zit onder de 50 ml conische buis
- Plaats 60ml spuit in spuitpomp (Zorg ervoor dat zowel de zuiger en het lichaam van de spuit zijn beide beveiligd).
- Bevestig de 3-weg stop-haan naar het einde van 60 ml spuit en spuit 5 ml 3-weg stop-cock bevestigen.
- Plaats Parallel Flow Kamer apparaten (GlycoTech, Inc) op de microscoop het podium met de input tube naar rechts, output tube naar links en vacuüm buis aan de achterkant.
- Bevestig de vacuum slang aan vacuüm-en open lucht ventiel om parallelle plaat apparaat te houden aan het podium. (Dit test als het vacuüm rok op de stroming kamer is luchtdicht.) Zet ventiel.
- Bevestig uitgang buis lijn (links van de microscoop) tot 3-weg stop-pik. Apparatuur is nu voorbereid om in de handel HBMEC-60 monolaag plaat.
- Plaats HBMEC-60 monolaag plaat en plaats in het midden van de microscoop.
- Zet vacuüm en de positie van de stroom kamer apparaat boven de plaat zodanig dat de monolaag plaat is in het centrum.
- Laat het apparaat stroom op de kamer HBMEC-60 monolaag plaat en laat vloeien kamer apparaat te zuigen naar beneden. (Er mogen geen geluiden van de lucht ontsnappen en op dit punt moet u mogelijk druk uit te oefenen op kamer om het rubber te comprimeren.)
- Zodra vacuüm tot stand is gebracht, plaats ingang buis (rechts) in de 50 ml conische buis met H / H met 2 mM CaCl 2.
- Open 3-weg stop-lul te stromen toe in de 60 ml spuit en plaats de pomp in de "pomp-modus."
- Voor het verwijderen van lucht uit input / output lijnen zonder de cellen op het bord, gebruik maken van de spuitpomp vastgesteld op 2mL/minute op de intake buis te vullen, dan snel ingesteld op 0,5 ml / minuut net voor de vloeistof het apparaat bereikt. Het is noodzakelijk om te primeren deze zorgvuldig opgezet en voorkomen dat luchtbellen die de monolaag zal lift van de plaat.
- Zodra vloeistof wordt gezien om te bewegen in de 60 ml spuit, de stroom kamer en spuitpomp zijn voorbereid en de Flow kamer is klaar voor gebruik. Deze set-up zal worden herhaald voor elke cel ingang lopen en voor elke behoefte aan nieuwe plaat.
4. Het vastleggen van Leukocyt Rolling Events het gebruik van NIS Elementen
- Open NIS elementen op het bureaublad.
- Druk op "play" icoon voor live-beeld. Automatische belichting kunt u zien dat de plaat gemakkelijker voor nu en is belangrijk om scherp te stellen.
- Zorg ervoor dat de juiste microscoop is gericht op de cel monolaag.
- Eenmaal gefocust, re-set blootstelling aan een beeld / seconde en stel licht op de microscoop. Het beeld zou moeten verschijnen op de computer en niet meer zichtbaar in de zoeker microscoop te wijten aan het lage lichtniveau. Licht histogram kan dan worden adjusted om belichting van de achtergrond verwijderen of cel duidelijkheid te verbeteren.
- Klik op de 2X2 bin of Live Bin aan de foto van die ideaal is voor filmopname te verkrijgen
- Klik op "Macro" op de menubalk en selecteer "schrijven naar de haven", selecteer port "COM3" en "open". (Dit opent de poort te coördineren met de spuitpomp.
- Pipetteer 1 ml van KG1a celsuspensie in de 5ml reageerbuis de buurt van de ingang buis lijn en plaats vervolgens inbreng buizen lijn naar de bodem van de reageerbuis.
- Ga naar de menubalk, klik op "Capture", "time-lapse overname."
- Een nieuw menu zal verschijnen. Selecteer het protocol duurzame 210 seconden, dit is de lengte van het programma voor rollend over HBMEC-60 cellen. (Elke fase is geprogrammeerd om een foto te maken elke seconde voor de duur van de pomp protocol. Het is ook ingesteld om een commando te sturen via de COM3 poort om de pomp te starten.) Indien een time-lapse wordt onderbroken, de pomp niet stopt op zijn eigen en moet opnieuw worden ingesteld. Druk op Annuleren om terug te keren om de afbeelding te leven.
- Stel de spuitpomp "Programma-modus", aldus de handleiding. (Programma-modus kunt voor het handmatig programmeren van specifieke debieten (dat wil zeggen shear stress) te worden meegedeeld binnen de kamer en KG1a cel interacties over de HBMEC-60 cel monolaag dicteren.) Instellingen voor KG1a cel rollen op hBMEC Cellen werden als volgt 4,2 dynes / cm 2 voor 45 s, 0,3 dynes / cm 2 voor 60 s, en stapsgewijze toename van om de 15 s tot een maximum van 4,2 dynes / cm 2
- Wandschuifspanning (W st) in de kamer werd berekend volgens de volgende vergelijking: W st = 6μQ / a 2 b, waarbij μ is de geschatte viscositeit van de media (0,0076 P), Q is het volumetrische debiet in ml / s, een is het kanaal hoogte (pakking dikte) in cm (0,03 cm), en b is het kanaal breedte in cm (0,5 cm). Debieten werden gereguleerd met behulp van het programma-modus van de spuitpomp.
- Microscoop en computer zijn nu klaar om time-lapse fotografie vast te leggen. Druk op "start run" op de computer om te beginnen met het verwerven van data. Terwijl het programma draait, moet u de media toe te voegen aan de reageerbuis met daarin KG1a cellen in stand te houden van de input / output buizen vol met medium (Zorg ervoor dat er geen luchtbellen).
5. Afhankelijkheid van Terminal sialylering en oppervlakte glycoproteïne voor E-selectine-Mediated KG1a Cell 5. Rolling (figuur 2; Video Clips van 5,1 tot 5,5)
- Het testen van KG1a cel rollen op niet-gestimuleerde HBMEC-60 cellen. (Negatieve controle) KG1a cellen werden bereid en toegediend in de stroom kamer meer dan levende niet-IL-1β-gestimuleerde HBMEC-60 zoals hierboven beschreven.
- Het testen van KG1a cel rollen op HBMEC-60 cellen voorbehandeld met IL-1β. (E-selectine-afhankelijkheid controle) KG1a cellen werden bereid en toegediend in de stroom kamer via live IL-1β-gestimuleerde HBMEC-60 zoals hierboven beschreven.
- Het testen van KG1a cel rollen op HBMEC-60 cellen voorbehandeld met IL-1β en vervolgens te neutraliseren anti-humaan E-selectine Moab. (E-selectine-afhankelijkheid controle) KG1a cellen werden bereid en toegediend in de stroom kamer over live IL- 1β gestimuleerde HBMEC-60 voorbehandeld met neutraliserende anti-humaan E-selectine Moab, zoals hierboven beschreven.
- Het testen van sialidase-verteerd KG1a cel rollen op IL-1β-gestimuleerde HBMEC-60. KG1a cellen voorbehandeld met 0.1U/ml Vibrio cholerae neuraminidase voor 1 uur bij 37 ° C werden voorbereid en toegediend in de stroom kamer via live IL-1β-gestimuleerde HBMEC-60 zoals hierboven beschreven.
- Het testen van de protease-verteerd KG1a cel rollen op IL-1β-gestimuleerde HBMEC-60. KG1a cellen behandeld met protease, waren 0.2U/ml bromelaïne voor 1 uur bij 37 ° C, bereid en toegediend in de stroom kamer via live IL-1β-gestimuleerde HBMEC-60 zoals hierboven beschreven.
6. Analyse van de NIS-Elementen-Gevangen KG1a cellen en Graphing van KG1a Cell Rolling gegevens
- Na de tijdreeks is verworven, slaat u de gegevens.
- Ga naar "maatregel" tab op de menubalk en selecteer "te definiëren drempel." Verplaats bars, zodat gewenste cellen worden gekleurd in het rood. Selecteer "Alle afbeeldingen" en vervolgens "Okay". De hele time-lapse sequence moet nu worden aangepast met een zichtbare rode rollende cellen.
- Ga naar "Measure" en kies "beperkingen." (Beperkingen kan de gebruiker thresholded objecten die niet vertegenwoordigen rollen cellen uit te sluiten. Dit wordt voornamelijk gecreëerd door de achtergrond HBMEC-60 monolaag.) Selecteer "gebied" en voer min en max-waarden van het gebied voor het rollen van cellen. Herhaal deze stap voor "verlenging" en "circulariteit."
- Selecteer "maatregel" en selecteer "te creëren met behulp van binaire beperkingen", en stel de beperking waarden NIS-Elements-software erkenning van rollend cellen optimaliseren monolaag van HBMEC-60 cellen.
- Ga terug naar "maatregel", selecteer "Field data", en vervolgens op 'reset data "te selecteren. Sluit dit menu.
- Ga terug naar "Measure" en seselecteer dan "scan veld".
- Open "Measure", "Field data", selecteer "nummer of de objecten" en selecteer "alle velden", en exporteren naar Microsoft Excel.
- Selecteer "duidelijke gegevens" aan de NOS-Elements cel overname voor te bereiden op de volgende gegevens te verzamelen.
Resultaten:
Figuur 3. Parallel-Plate Flow Kamer Analyse van E-selectine-bindende activiteit op KG1a cellen. KG1a cellen behandeld met sialidase of protease werden geanalyseerd voor het walsen van efficiency op monolagen van HBMEC-60 cellen voorbehandeld met IL-1β. Negatieve controle rollende experimenten werden ook uitgevoerd door het analyseren KG1a cel rollen op niet-IL-1β-gestimuleerde HBMEC -60 cellen of op IL-1β-gestimuleerde HBMEC-60 cellen behandeld met neutraliserende anti-humaan E-selectine Moab (5D11). Cel rollen frequenties werden in drievoud uitgevoerd en geanalyseerd met NOS-Elements-software. (* Statistische significantie, p <0,001)
In deze video-gebaseerde rapport, we een visuele voorstelling van hoe de leukocyten te analyseren - endotheliale cel interacties onder fysiologische shear stress omstandigheden. In het bijzonder, analyseerden we de rol van E-selectine - E-selectine liganden in het bemiddelen van leukocyten tethering en rollend, een lijm gedrag die noodzakelijk zijn voor inzet van secundaire meer stabiele binding activiteiten door middel van receptoren, zoals integrines en hyaluronan receptoren. Met behulp van de parallelle plaat stroom kamer aangepast voor gebruik met een omgekeerde microscoop, Harvard-spuitpomp, video-camera en computer / cel acquisitie hardware, voerden we experimenten waarin E-selectine ligand + KG1a cellen werden gebruikt als onze leukocyten model en hBMEC cellen (HBMEC- 60) gestimuleerd met pro-inflammatoire cytokine IL-1β, werden gebruikt als onze E-selectine + humane endotheelcellen model (1-6). Zoals eerder gemeld, zagen we robuuste KG1a cel rollen op IL-1β-gestimuleerde HBMEC-60 cellen over een bereik van shear stress niveaus in een E-selectine-afhankelijke manier (figuur 3) (statistisch significant verschil in vergelijking met KG1a cel rollen op niet-IL-1β gestimuleerd HBMEC-60 cellen). Negatieve controles, die bestond uit KG1a cel rollen op niet-IL-1β-gestimuleerde HBMEC-60 cellen of op IL-1β-gestimuleerde HBEMC-60 cellen behandeld met anti-humaan E-selectine mAb, werden uitgevoerd in parallel aan de afhankelijkheid aan te tonen van de cytokine stimulatie en E-selectine expressie voor het walsen activiteit (figuur 3). Bovendien, rollende analyse van KG1a cellen voorbehandeld met Vibrio cholerae neuraminidase (sialidase) of met bromelaïne, een niet-specifieke protease bekend voor de vertering van het oppervlak E-selectine glycoproteïne ligand, gewezen op het belang van terminale siaalzuurresten en oppervlakte glycoproteïne voor E-selectine ligand activiteit (2,3).
Discussion
Parallelle plaat stroom kamer-analyse is een gespecialiseerd in-vitro-assay systeem gebruikt voor het bestuderen van leukocyten - endotheliale lijm interacties onder schuifspanning soortgelijke voorwaarden als die bijgebracht op het oppervlak van een post-capillaire venule. Zoals hier in onze visuele presentatie afgebeeld, tonen we de waarde van dit systeem voor het onderzoeken van de rol van E-selectine - E-selectine liganden in het bemiddelen van leukocyten tethering en rollen op het oppervlak van geactiveerde microvasculaire endotheel. We laten ook de toepassing van de protease, glycosidase en blokkerend antilichaam behandelingen voor het ophelderen van de rol van E-selectine en zijn liganden in dit systeem. Deze analyses zijn zeer reproduceerbaar en helpen vormen een experimentele basis voor het bestuderen van E-selectine - E-selectine ligand-functie in vivo.
Naast het bestuderen van cel adhesie met monolagen van cytokine-geactiveerde microvasculaire endotheelcellen (hBMEC of menselijke navelstreng of dermale microvasculaire endotheelcellen), kunnen testen worden uitgevoerd met behulp van gezuiverd recombinant humaan E-selectine of E-selectine-Ig chimère moleculen als een substraat voor celadhesie. Andere adhesieve interacties gemedieerd door leukocyten (L-)-selectine en bloedplaatjes (P)-selectine kunnen ook worden getest met behulp van parallelle plaat stroom kamer-technologie. Door te variëren met het type cel monolaag / eiwit substraat of van input leukocyten / selectine-transfectant cel modellen, onderzoekers kan de rol van deze interacties te bestuderen onder fysiologische shear stress omstandigheden.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten of toelichtingen.
Acknowledgments
De financiering voor dit project werd verstrekt door een American Cancer Society Research Scholar Award, (06-024-01-CSM naar Charles J. Dimitroff), een National Institutes of Health / National Cancer Institute te verlenen (RO1CA118124 Charles J. Dimitroff), en een National Institutes of Health / Nationaal Instituut van artritis en spier-en huidziekten te verlenen (P30 AR042689 aan Dr Thomas S. Kupper, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178-500ML | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| 0.5 M EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 15575-038 | |
| 1M HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| Parallel-Plate Flow Chamber Kit | GlycoTech | 31-001 | |
| PHD2000 Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| 35x10mm Tissue Culture Dish | BD Biosciences | 353001 | |
| Fibronectin , from human plasma | Sigma-Aldrich | 86088-83-7 F2006-2MG | |
| Interleukin-1_, Human; Recombinant | Sigma-Aldrich | I9401-5UG | |
| HBSS (Hank s Buffered Saline Solution) | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| Medium 199 w/ HEPES & Glutamine | Invitrogen | 12320-039 | |
| Human Serum | Innovative Research, Inc. | IPLA-SER1 | |
| Heparin | Abraxis BioScience | 504011 | |
| Recombinant human fibroblast growth factor | R&D Systems | 233-FB | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Plastic Test tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Anti-human E-selectin clone BBIG-E4(5D11) | R&D Systems | BBA16 | |
| Bromelain | Sigma-Aldrich | B-4882 |
References
- Dimitroff, C. J., Kupper, T. S., Sackstein, R. Prevention of leukocytic migration to inflamed skin with a novel fluorosugar modifier of cutaneous lymphocyte-associated antigen. J. Clin. Invest. 112, 1008-1018 Forthcoming.
- Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
- Dimitroff, C. J., Descheny, L., Trujillo, N., Kim, R., Nguyen, V., Huang, W., Pienta, K. J., Kutok, J. L., Rubin, M. A. Identification of leukocyte E-selectin ligands, P-selectin glycoprotein ligand-1 and E-selectin ligand-1, on human metastatic prostate tumor cells. Cancer Res. 65, 5750-5760 (2005).
- Descheny, L., Gainers, M. E., Walcheck, B., Dimitroff, C. J. Ameliorating Skin-Homing Receptors on Malignant T cells with a Fluorosugar Analog of N-acetylglucosamine: P-selectin Ligand is a More Sensitive Target than E-selectin Ligand. J Invest Dermatol. 126 (9), 2065-2073 (2006).
- Gainers, M. E., Descheny, L., Barthel, S. B., Liu, L., Wurbel, M., Dimitroff, C. J. Skin-homing receptors on effector leukocytes are differentially sensitive to glyco-metabolic antagonism in allergic contact dermatitis. J. Immunology. 179 (12), 8509-8518 (2007).
- Rood, P. M., Calafat, J., von dem Borne, A. E., Gerritsen, W. R., van der Schoot, C. E. Immortalization of human bone marrow endothelial cells: characterisation of new cell lines. Eur J Clin Invest. 30 (7), 618-629 (2000).
