Analys av Fysiologiska E-selektin-medierad Leukocyt rullar på Microvascular endotelet

Summary

Denna rapport ger en visuell återgivning av parallell-plattan flöde kammare analys för att studera leukocyt endotelceller interaktion under fysiologiska skjuvspänning. Den här metoden är särskilt användbar för att undersöka rollen av endotelceller (E)-selektin och leukocyt E-selektin ligander som utlöser leukocyt rullar på endotelceller ytor.

Abstract

E-selektin är en typ-1 membran protein på mikrovaskulära endotelceller som hjälper initiera rekryteringen av cirkulerande leukocyter till kutana, ben och inflammerad vävnad. E-selektin uttryck är konstituerande på huden och ben mikrokärl och inducerbara av proinflammatoriska cytokiner såsom IL-1α / och TNF-α, på mikrokärl i inflammerade vävnader. Detta lektin receptorn medierar svag bindning interaktioner med kolhydrater counter-receptor ligander på cirkulerande leukocyter, vilket resulterar i en karakteristisk rullande beteende. Eftersom dessa interaktioner föregå mer stabil självhäftande händelser och diapedesis aktivitet, karakterisering av leukocyt rullande aktivitet och identifiering av leukocyt E-selektin ligander har varit viktiga mål i studier av leukocyt människohandel och inflammation och i utvecklingen av anti-inflammatoriska läkemedel (1-5) . Avsikten med denna rapport är att ge en visuell, övergripande beskrivning av de mest använda tekniken för att studera E-selektin E-selektin ligand interaktioner under fysiologiska förhållanden blodflödet. Vårt laboratorium i samband med Harvard Skin Disease Research Center använder en state-of-the-art parallell-platta apparater flöde kammare tillsammans med digital visualisering och ny inspelning programvara, NIS-element. Denna teknologi tillåter oss att analysera vidhäftning händelser i realtid för skärmen visualisering samt spela rullande aktivitet i ett videoformat. Celladhesion parametrar såsom rullande frekvens, skjuvhållfasthet och bindande / tjudra effektivitet beräknas med NIS-Elements, exporteras till ett Excel-ark och utsättas för statistisk analys. I demonstrationen som presenteras här, anställd vi parallell-plattan flödeskammare att undersöka E-selektin-beroende leukocyt rullande aktivitet på levande mänskliga endotelceller benmärgsceller (hBMEC). Mänskliga hematopoetiska progenitorceller KG1a celler, som uttrycker en hög grad av E-selektin ligand, har använts som vår leukocyt-modell, medan en förevigat hBMEC cellinje, HBMEC-60 celler, användes som vår endotelceller-modell (6). Att inducera och simulera native E-selektin uttryck i flödet kammare, HBMEC-60 celler var först aktiveras med IL-1. Vår videopresentation visade att parallell-platta flödesanalys är en lämplig metod för att studera fysiologiska E-selektin-medierad leukocyt rullande verksamhet och att funktionell karakterisering av leukocyt E-selektin ligand (er) i flödet kammaren kan säkerställas genom att implementera proteashämmare eller glycosidase digestions.

Protocol

1. Beredning av hBMEC (HBMEC-60 Cell) cellslager på petriskålar för Flow avdelningen Coat 35 x 10mm vävnad-kultur rätter med 2 ml 20μg/ml fibronektin (i PBS) över natten vid 4 ° C eller i 3 timmar vid 37 ° C. Aspirera fibronektin lösning från maträtter och tillsätt 1,5 x10 5 HBMEC-60 celler [Medium 199 med HEPES & glutamin, 10% FBS, 10% humanserum, 5 enheter / ml heparin, 1ng/ml rekombinant humant fibroblast tillväxtfaktor, 1% Penicillin- streptomycin] till skålen och låta dem växa till> 90% sammanflödet. (Detta tar 2 dagar) Aspirera tillväxt media och, till upp-reglera E-selektin uttryck, lägg färska medium med 50ng/mL IL-1β i 4-6 timmar. Cell monolager är nu redo för rullande analysen. Att spärra e-selektin funktion, neutraliserande anti-humant E-selektin Moab (klon BBIG-E4 (5D11)) kan läggas till 20μg/ml för ~ 1 timme vid 37 ° C. 2. Beredning av mänskliga Hematopoietic progenitorceller KG1a för Flow avdelningen Mänskliga hematopoetiska stamceller KG1a celler odlas till confluency (1×10 6 celler / ml) i RPMI-1640 med glutamin och 10% FBS / 1% penicillin-streptomycin och är pipetteras direkt från kolven för användning i flödet kammare analys. Cell antal beräknas med en hemacytometer och sedan celler resuspenderas vid 1 x 10 6 celler / ml i HBSS med 10mm HEPES (H / H buffert) och 2mm CaCl 2 Celler lagras på is tills det ska användas i analysen. 3. Beredning av Mikroskop, Parallell-Plate Flow avdelningen och sprutpump (Figur 1) Figur 1. Illustration av parallell-tavla Flow avdelningen Analys. Inverterat mikroskop, Harvard sprutpump, dator / kamera och parallell-platta flöde kammare placeras i ett optimalt arrangemang för effektiv och reproducerbar cell analys. Slå på strömmen och ljuskälla till inverterat mikroskop och makt att sprutpump och välj 10X mål på mikroskopet. Placera 50mL koniska röret i hållaren och fyll med H / H och 2mm CaCl 2. Placera 5ml plast provrören i provrör hållaren under 50mL koniska röret Placera 60 ml sprutan i sprutpump (Var noga med att både kolv och kropp spruta är båda säkrade). Fäst 3-vägs stop-kuk till slutet av 60 ml sprutan och fäst 5 ml spruta för att 3-vägs stop-kuk. Placera parallellt flöde avdelningen apparater (GlycoTech, Inc.) på mikroskop scenen med ingång röret till höger, utgång röret till vänster och sugrör på baksidan. Fäst vakuum slang till vakuum och öppna luftventilen att tillåta parallella tallrik apparater att ansluta sig till scenen. (Detta test om vakuum kjol på flödet kammaren är lufttät.) Stäng luftventil. Fäst linjeutgång slang (till vänster i mikroskop) för 3-vägs stop-kuk. Apparaten är nu redo för utsläppande på HBMEC-60 monolager plåt. Placera HBMEC-60 cellslager tallrik och lägg på mitten av mikroskop. Slå på vakuum och ställning flödet kammaren apparaten ovanför plattan så att cellslager plattan i centrum. Lägg försiktigt ner apparaten flödet kammaren på HBMEC-60 cellslager plattan och låt flöde kammare apparater till sug ner. (Det bör inte finnas några ljud av luft som kommer ut och på denna punkt kan du behöva att sätta press på kammaren för att komprimera gummipackning.) När vakuum har fastställts, placera in röret (till höger) i 50mL koniska röret med H / H med 2mm CaCl 2. Öppna 3-vägs stop-kuk så att flöda in i 60ml spruta och placera pumpen i "pump-läge." För att ta bort luft från input / output linjer utan att lyfta cellerna på plattan, använd sprutpumpen inställd på 2mL/minute att fylla intaget röret, sedan snabbt in på 0,5 ml / minut precis innan vätskan når apparaten. Det är absolut nödvändigt att prima denna uppsättning sig försiktigt och undvika luftbubblor som kommer att lyfta cellslager från plattan. När vätskan ses att flytta in i 60ml sprutan flödet kammaren och sprutpump har primas och flödet kammaren är klar för användning. Detta inrättas kommer att upprepas för varje cell ingång springa och för varje ny behövs platta. 4. Fånga Leukocyte Rolling händelser med hjälp av NIS Elements Öppna NIS Elements på skrivbordet. Tryck på "play"-ikonen för live bild. Automatisk exponering gör att du kan se plattan lättare för nu och är viktig för fokusering. Se till att mikroskop är fokuserad ordentligt på cellen monolager. När fokuserad, på nytt ställa exponering för 1 bild / sekund och justerar ljus på mikroskopet. Bilden ska visas på datorn och inte längre vara synlig i mikroskop sökaren grund av den låga ljusnivån. Ljus histogrammet kan då annonsenteras att ta bort bakgrunden exponering eller förbättra cell klarhet. Klicka på 2X2 bin eller Live Bin för att få bild som är idealisk för filmning Klicka på "Makro" på menyraden och välj "skriva till port", välj port "COM3" och "öppna". (Detta öppnar porten för att samordna med sprutpump. Pipettera 1 mL KG1a cellsuspension i 5ml provröret nära ingången slangen linje och sedan placera linjeingång slang till botten av provröret. Gå till menyraden, klicka på "Capture", "time-lapse förvärv." En ny meny dyker upp. Välj det protokoll som varar 210 sekunder, detta är längden på programmet för rullande på HBMEC-60 celler. (Varje fas är programmerad att ta en bild varje sekund under hela pumpens protokollet. Det är också inrättas för att skicka ett kommando genom COM3 port för att starta pumpen.) Om time-lapse avbryts, kommer pumpen inte att stoppa på egen hand och måste återställas. Tryck på Avbryt för att återgå till live-bild. Ställ sprutpumpen till "Program Mode" enligt bruksanvisning. (Program-läge tillåter manuell programmering av specifika flöden (dvs skjuvspänning nivåer) som ska förmedlas i kammaren och diktera KG1a cell interaktioner över HBMEC-60 cell monolager.) Inställningar för KG1a cell rullar på hBMEC Celler var följande 4,2 dynes / cm 2 för 45 s, 0,3 dynes / cm 2 för 60 s, och stegvis ökar varje 15 s till max 4,2 dynes / cm 2 Wall skjuvspänningen (W st) i kammaren har beräknats enligt följande formel: W m = 6μQ / a 2 b, där μ är den beräknade viskositeten av materialet (0,0076 P), Q är den volymetriska flöde i ml / s, är en kanal höjd (packning tjocklek) i cm (0,03 cm), och b är kanalens bredd i cm (0,5 cm). Flödena reglerades med hjälp av programmet läget på sprutpump. Mikroskop och datorer är nu redo att ta time-lapse fotografering. Tryck på "Start Kör" på datorn för att börja skaffa information. Medan du kör programmet, se till att lägga till media i provröret som innehåller KG1a celler för att hålla input / output slang full av medium (Se till att det inte finns några luftbubblor). 5. Beroendet av Terminal Sialylation och Surface Glykoprotein för E-selektin-medierad KG1a Cell 5. Rolling (Figur 2, Videor Klipp från 5,1 till 5,5) Testmetoder av KG1a cell rullande på icke-stimulerad HBMEC-60 celler. (Negativ kontroll) var KG1a celler förberedd och infunderas i flödet kammaren över levande icke-IL-1β-stimulerad HBMEC-60 enligt ovan. Testmetoder av KG1a cell rullande på HBMEC-60 celler förbehandlade med IL-1β. (E-selektin beroendet kontroll) KG1a celler var förberedd och infunderas i flödet kammaren under live-IL-1β-stimulerad HBMEC-60 enligt ovan. Testmetoder av KG1a cell rullande på HBMEC-60 celler som förbehandlats med IL-1β och sedan neutraliserande anti-humant E-selektin Moab. (E-selektin beroendet kontroll) KG1a celler var förberedd och infunderas i flödet kammaren under live-IL- 1β-stimulerad HBMEC-60 förbehandlas med neutraliserande anti-humant E-selektin Moabs som beskrivits ovan. Testmetoder av sialidase smält-KG1a cell rullar på IL-1β-stimulerad HBMEC-60. KG1a celler förbehandlats med 0.1U/ml Vibrio cholerae neuraminidas för 1 timme vid 37 ° C utarbetades och infunderas i flödet kammaren under live-IL-1β-stimulerad HBMEC-60 enligt ovan. Testmetoder av proteas smält-KG1a cell rullar på IL-1β-stimulerad HBMEC-60. KG1a celler förbehandlade med proteashämmare, var 0.2U/ml Bromelain för 1 timme vid 37 ° C, förberedd och infunderas i flödet kammaren under live-IL-1β-stimulerad HBMEC-60 enligt ovan. 6. Analys av NIS-Elements-Fångade KG1a celler och rita av KG1a Cell Rolling Data Efter tidsföljd förvärvas, spara data. Gå till "mäta" fliken på menyraden och välj "definiera tröskel." Flytta barer så att önskade celler är färgade i rött. Välj "alla bilder" och sedan "OK". Hela tidsförlopp ordning bör nu ändras med synligt rött rullande celler. Gå till "åtgärd" och välj "restriktioner". (Begränsningar tillåter användaren att utesluta thresholded objekt som inte utgör rullande celler. Detta beror främst bakgrunden skapas av HBMEC-60 monolager.) Välj "område" och mata in min och max värden för området för rullande celler. Upprepa detta steg för "förlängning" och "rund". Välj "åtgärd" och välj "skapa binära med restriktioner" och ange begränsningsvärden för att optimera NIS-Elements erkännande av rullande celler monolager av HBMEC-60 celler. Gå tillbaka till "åtgärd", välj "Field data" och välj sedan "Reset data". Stäng den här menyn. Återgå till "åtgärd" och sevälja "scanna fältet". Öppna "Mät", "Field data", välj "nummer eller objekt" och välj sedan "alla fält" och exportera data till Microsoft Excel. Välj "tydliga uppgifter" för att förbereda NIS-element cell förvärv för nästa datainsamling. Resultat: Figur 3. Parallell-tavla Flow avdelningen Analys av E-selektin-bindande aktivitet på KG1a celler. KG1a celler som behandlats med sialidase eller proteashämmare analyserades för rullande effektivitet på monolager av HBMEC-60 celler som tidigare behandlats med IL-1β. Negativ kontroll rullande experiment genomfördes också genom att analysera KG1a cell rullande på icke-IL-1β-stimulerad HBMEC -60 celler eller på IL-1β-stimulerad HBMEC-60 celler som behandlats med neutraliserande anti-humant E-selektin Moab (5D11). Cell rullande frekvenser utfördes i tre exemplar och analyseras med NIS-Elements. (* Statistisk signifikans, p <0,001) I den här videon baserad rapport, förutsatt att vi en visuell skildring av hur man analyserar leukocyt – endotelceller interaktion under fysiologiska skjuvspänning förhållanden. I synnerhet analyserade vi roll som e-selektin – E-selektin ligander att medla leukocyt tjudra och rullande, ett lim beteende nödvändigt för engagemang av sekundära mer stabil bindande verksamhet via receptorer, såsom integriner och hyaluronan receptorer. Använda parallell-plattan flöde kammare anpassade för användning med ett inverterat mikroskop, Harvard sprutpump, videokamera och dator / cell förvärv hårdvara, genomförde vi experiment där E-selektin liganden + KG1a celler som användes som vår leukocyt modell och hBMEC celler (HBMEC- 60) stimuleras med pro-inflammatorisk cytokin, IL-1β, användes som vår E-selektin + mänskliga endotelceller modell (1-6). Som tidigare rapporterats, konstaterade vi robusta KG1a cell rullar på IL-1β-stimulerad HBMEC-60 celler över en rad skjuvspänning nivåer i ett e-selektin-beroende sätt (Figur 3) (Statistiskt signifikant skillnad jämfört med KG1a cell rullar på icke-IL-1β stimuleras HBMEC-60 celler). Negativa kontroller, som bestod av KG1a cell rullande på icke-IL-1β-stimulerad HBMEC-60 celler eller på IL-1β-stimulerad HBEMC-60 celler förbehandlats med anti-humana E-selektin MAB, utfördes parallellt för att demonstrera beroendet av cytokin stimulering och E-selektin uttryck för rullande aktivitet (Figur 3). Dessutom rullande analys av KG1a celler förbehandlats med Vibrio cholerae neuraminidas (sialidase) eller med bromelain, en icke-specifik proteas känd för att smälta ytan E-selektin glykoprotein ligand, betonade vikten av terminal sialinsyra rester och ytan glykoprotein för E-selektin ligand aktivitet (2,3).

Discussion

Parallell-platta flöde kammare analys är en specialiserad in vitro-test som används för att studera leukocyt – endotelceller självhäftande interaktion under skjuvspänningen villkor liknande de som förmedlas på ytan av en post-kapillär venule. Som skildras här i vår visuella presentationen visar vi värdet av detta system för att utreda rollen av E-selektin – E-selektin ligander att medla leukocyt tjudra och rulla på ytan av aktiverade mikrovaskulära endotelet. Vi avslöjar också tillämpningen av proteas, glycosidase och blockering behandlingar antikropp för att belysa betydelsen av E-selektin och dess ligander i detta system. Dessa analyser är mycket reproducerbar och hjälper bilda ett experiment för att studera e-selektin – E-selektin ligand funktion in vivo.

Förutom att studera cellers vidhäftning med monolager av cytokin-aktiverade mikrovaskulära endotelceller (hBMEC eller mänskliga navelsträngen ven eller dermal mikrovaskulära endotelceller) kan analyser utföras med renat rekombinant humant E-selektin eller E-selektin-Ig chimär molekyler som substrat för cell vidhäftning. Andra lim interaktioner förmedlade genom leukocyt (L-)-selektin och trombocyter (P)-selektin kan också analyseras med hjälp av parallell-plåt-teknik flöde kammare. Genom att variera typen av cell monolager / protein substrat eller av input leukocyt / selektin-transfectant modeller cell, kan forskare studera betydelsen av dessa interaktioner under fysiologiska förhållanden skjuvspänning.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
FBS		SIGMA	F6178-500ML
DPBS		GIBCO	14190
0.5 M EDTA		GIBCO	15575-038
1M HEPES		GIBCO	15630
Parallel-Plate Flow Chamber Kit		GlycoTech	31-001
PHD2000 Programmable Syringe Pump		Harvard Apparatus	PHD 2000
35x10mm Tissue Culture Dish		BD FALCON	353001
Fibronectin , from human plasma		SIGMA	86088-83-7 F2006-2MG
Interleukin-1_, Human; Recombinant		SIGMA	I9401-5UG
HBSS (Hank s Buffered Saline Solution)		GIBCO	14170
Medium 199 w/ HEPES & Glutamine		Invitrogen	12320-039
Human Serum		Innovative Research, Inc.	IPLA-SER1
Heparin		Abraxis Pharmaceutical Products	504011
Recombinant human fibroblast growth factor		R&D Systems	233-FB
Penicillin Streptomycin		GIBCO	15140
Plastic Test tubes		BD Bioscience	352008
Anti-human E-selectin clone BBIG-E4(5D11)		R&D Systems	BBA16
Bromelain		SIGMA	B-4882