Summary
Este relatório fornece uma representação visual de placas paralelas análise câmara de fluxo para o estudo de interações leucócitos endoteliais sob tensão de cisalhamento fisiológico. Este método é particularmente útil para investigar o papel do endotélio (E)-selectina e E-selectina leucócitos ligantes que leucócitos gatilho rolando na superfície das células endoteliais.
Abstract
E-selectina é uma proteína de membrana tipo-1 em células endoteliais microvasculares que ajuda a iniciar o recrutamento de leucócitos circulantes para os tecidos ósseos cutânea, e inflamado. E-selectina expressão é constitutiva de microvasos dérmica e óssea e é induzível por citocinas pró-inflamatórias, como IL-1α / TNF-α e, em microvasos em tecidos inflamados. Este receptor medeia a lectina fracas interações de ligação com carboidratos contra receptor-ligantes em leucócitos circulantes, o que resulta em um comportamento característico de rolamento. Porque essas interações precedem eventos adesivo mais estável e atividade diapedese, caracterização da atividade rolling de leucócitos e identificação de leucócitos E-selectina ligantes foram objetivos principais em estudos de tráfico de leucócitos e inflamação e no desenvolvimento de terapêuticas anti-inflamatórios (1-5) . A intenção deste relatório é fornecer uma descrição, visual abrangente da tecnologia mais amplamente utilizada para estudar a E-selectina E-selectina interações ligante sob condições de fluxo fisiológico de sangue. Nosso laboratório em conjunto com o Centro de Pesquisas de Doenças da Pele Harvard usa um state-of-the-art de placas paralelas aparelhos de câmara de fluxo acompanhada através da visualização digital e software de gravação de novo, NIS Elements. Esta tecnologia permite-nos analisar os eventos de adesão em tempo real para visualização na tela assim como a atividade registro rolando em um formato de vídeo. Parâmetros de adesão celular, tais como a resistência ao rolamento, frequência de corte e ligação / tethering eficiência, são calculados com NIS Elements software, exportados para uma planilha do Excel e submetidos à análise estatística. Na demonstração apresentada aqui, foi empregado o câmara de fluxo de placas paralelas para investigar E-selectina-dependente a atividade de leucócitos rolando ao vivo medula óssea humana endotelial (hBMEC). Células progenitoras hematopoéticas KG1a, que expressam um alto nível de E-selectina ligante, foram utilizados como nosso modelo de leucócitos, enquanto que uma linha celular imortalizada hBMEC, HBMEC-60 celas, foi usado como nosso modelo de células endoteliais (6). Para induzir e simular expressão E-selectina nativa na câmara de fluxo, HBMEC-60 células foram ativado pela primeira vez com a IL-1. Nossa apresentação de vídeo mostrou que placas paralelas análise de fluxo é um método adequado para estudar a E-selectina mediada fisiológico de leucócitos atividades rolamento e que a caracterização funcional de ligante E-selectina leucócitos (s) na câmara de fluxo pode ser verificada através da implementação de protease ou glicosidase digestões.
Protocol
1. Preparação de hBMEC (HBMEC-60 Cell) monocamada em placas de Petri para a Câmara de Fluxo
- Revestimento 35 x 10mm cultura de tecidos de pratos com 2ml de fibronectina 20μg/ml (em PBS) durante a noite a 4 ° C ou por 3 horas a 37 ° C.
- Aspirar solução fibronectina dos pratos e acrescente 1,5 x10 5 células HBMEC-60 [Meio 199 com HEPES e Glutamina, 10% FBS, 10% de soro humano, 5 unidades / ml de heparina, 1ng/ml fator de crescimento humano recombinante de fibroblastos, 1% Penicilina- estreptomicina] para o prato e permitir-lhes crescer a> confluência de 90%. (Isso leva 2 dias)
- Aspirar meios de crescimento e, para se regular-E-selectina expressão, adicione meio fresco com IL-1β 50ng/mL para 4-6 hrs. Monocamadas de células agora está pronto para rolar ensaio. Para bloquear E-selectina função, neutralizando anti-humano E-selectina Moab (clone BBIG-E4 (5D11)) podem ser adicionados a 20μg/ml para ~ 1h a 37 ° C.
2. Preparação de células progenitoras hematopoéticas KG1a para Câmara de Fluxo
- Células progenitoras hematopoéticas KG1a são cultivadas a confluência (1x10 6 células / ml) em RPMI-1640 com glutamina e 10% FBS / 1% de penicilina-estreptomicina e são pipetados diretamente do frasco para utilização em ensaio de câmara de fluxo.
- Número de células é calculada usando um hemocitômetro e depois as células são re-suspenso em 1 x 10 6 células / mL em HBSS com 10 mM HEPES (H / H buffer) e CaCl 2 2mM
- Células são armazenadas no gelo até a sua utilização no ensaio.
3. Preparação de Microscópio Câmara de Fluxo, de placas paralelas e bomba de seringa (Figura 1)
Figura 1. Ilustração de placas paralelas Análise Câmara de Fluxo. Microscópio invertido, Harvard bomba de seringa, computador de câmera / e de placas paralelas câmara de fluxo são colocados em um arranjo ideal para análise de células eficientes e reprodutíveis.
- Ligue a alimentação e fonte de luz para microscópio invertido e poder de bomba de seringa e selecione a objetiva de 10x no microscópio.
- Coloque 50 mL em tubo cônico titular e encher com H / H e 2mM CaCl 2.
- Lugar de tubos de plástico de 5 ml de teste em tubo de ensaio titular abaixo do tubo de 50 ml cônico
- Coloque 60ml seringa na bomba de seringa (Certifique-se que tanto o êmbolo da seringa e do corpo são ambos garantidos).
- Anexar 3 vias-stop pau-de-final da seringa 60ml e anexar seringa de 5 ml para 3 vias-stop-galo.
- Coloque aparelho Câmara paralela de fluxo (GlycoTech, Inc.) no palco microscópio com tubo de entrada para a direita, tubo de saída para a esquerda e tubo de vácuo para trás.
- Anexar tubos de vácuo para vácuo e válvula de ar livre para que os aparelhos de placas paralelas para aderir ao palco. (Isso testa se a saia de vácuo na câmara de fluxo é hermético.) Desligue a válvula de ar.
- Ligar a linha de saída de tubos (à esquerda de microscópio) para 3-way-stop-galo. Aparelho está agora preparado para a colocação no HBMEC-60 placa monocamada.
- Coloque placa de monocamada HBMEC-60 e colocar no centro do microscópio.
- Ligue vácuo e posição do aparelho câmara de fluxo acima da placa de tal forma que a placa monocamada está no centro.
- Delicadamente mais baixo do aparelho câmara de fluxo na placa monocamada HBMEC-60 e que os aparelhos câmara de fluxo de sucção para baixo. (Não deve haver nenhum som de ar escapando e, neste ponto você pode precisar de aplicar pressão sobre a câmara para comprimir a junta de borracha).
- Uma vez vácuo foi estabelecido, tubo de entrada local (à direita) para dentro do tubo cônico contendo 50mL H / H com 2mM CaCl 2.
- Abrir 3 vias-stop-galo para permitir o fluxo para a seringa 60ml e bomba lugar no "modo de bomba."
- Para retirar o ar de entrada / saída de linhas sem levantar as células na placa, use a bomba de seringa fixada em 2mL/minute para encher o tubo de entrada, em seguida, definir rapidamente a 0,5 mL / minuto apenas antes de o líquido atinge o aparelho. É imperativo para preparar este jogo com cuidado e evitar bolhas de ar que vai levantar a monocamada da placa.
- Uma vez que o fluido é visto para entrar na seringa 60ml, a câmara de fluxo e bomba de seringa foram preparadas e da câmara de fluxo está pronto para uso. Esta configuração será repetido para cada execução de entrada de célula e para cada novo prato necessário.
4. Captura dos leucócitos Eventos do Rolling usando NIS Elements
- Elementos aberta NIS no desktop.
- Pressione o botão "play" ícone para imagem ao vivo. Exposição automática permitirá que você ver a placa mais fácil para agora e é importante para focagem.
- Certifique-se que microscópio está focado corretamente na monocamada de células.
- Uma vez focada, a exposição re-set a 1 luz de quadros / segundo e ajustar no microscópio. A imagem deve aparecer no computador e não estar mais visível no visor do microscópio, devido ao nível de pouca luz. Histograma de luz pode então ser adajustada para eliminar a exposição de fundo ou melhorar a clareza da célula.
- Clique em bin 2X2 ou Bin Live para obter imagem que é ideal para captura de filme
- Clique em "Macro" na barra de menu e selecione "gravar na porta"; selecione a porta "COM3" e "aberto". (Isso abre a porta para coordenar com a bomba de seringa.
- Pipetar 1 ml de suspensão de células KG1a no tubo de ensaio 5ml perto da linha de tubulação de entrada e em seguida, coloque linha de tubulação de entrada para o fundo do tubo de ensaio.
- Ir para barra de menus, clique em "Capture", "aquisição de lapso de tempo."
- Um novo menu irá aparecer. Selecione o protocolo com duração 210 segundos, esta é a duração do programa para rolar em HBMEC-60 Cells. (Cada fase é programado para tirar uma foto a cada segundo para a duração do protocolo de bomba. Também é configurado para enviar um comando através da porta COM3 para ligar a bomba.) Se lapso de tempo é interrompida, a bomba não vai parar por conta própria e deve ser reposto. Pressione Cancelar para voltar a viver da imagem.
- Definir a bomba de seringa para "Modo de Programação" de acordo com manual de instruções. (Modo Programa permite a programação manual de taxas de fluxo específico (ou seja, níveis de estresse de cisalhamento), a ser transmitido dentro da câmara e ditar as interações célula KG1a sobre a monocamada de células HBMEC-60.) Configurações para KG1a célula rolando em Células hBMEC foram os seguintes 4,2 dinas / cm 2 por 45 s, 0,3 dinas / cm 2 por 60 s, e aumenta gradualmente a cada 15 s até um máximo de 4,2 dinas / cm 2
- Parede de tensão de cisalhamento (W st) na câmara foi calculada de acordo com a seguinte equação: W st = 6μQ / a b 2, onde μ é a viscosidade estimada dos meios de comunicação (0,0076 P), Q é a vazão volumétrica em ml / s, a é a altura do canal (espessura da junta) em cm (0,03 cm), e b é a largura do canal em cm (0,5 cm). Vazões foram regulamentados usando o modo de programação da bomba de seringa.
- Microscópio e computador agora está pronto para capturar lapso de tempo fotografia. Pressione "start run" no computador para começar a aquisição de dados. Durante a execução do programa, não se esqueça de adicionar mídia para o tubo de ensaio contendo células KG1a a fim de manter a tubulação de entrada / saída completa do meio (Certifique-se que não há bolhas de ar).
5. Dependência de sialilação Terminal e glicoproteína de superfície de E-selectina-mediada por células KG1a 5. Rolamento (Figura 2; Vídeos Clipes de 5,1-5,5)
- Dosagem de KG1a célula rolando sobre a não-estimulada HBMEC-60 células. (Controle negativo), células KG1a foram preparados e injetado na câmara de fluxo mais viver não-IL-1β estimulada HBMEC-60 conforme descrito acima.
- Dosagem de célula KG1a rolando no HBMEC-60 células pré-tratadas com IL-1β. (E-selectina-dependência controle) KG1a células foram preparados e injetado na câmara de fluxo mais viver IL-1β estimulada HBMEC-60 conforme descrito acima.
- Dosagem de célula KG1a rolando no HBMEC-60 células pré-tratadas com IL-1β e neutralizantes anti-humano E-selectina Moabe. (E-selectina-dependência controle) KG1a células foram preparados e injetado na câmara de fluxo mais viver IL- 1β estimulada HBMEC-60 pré-tratados com anti-humano neutralizando Moabe E-selectina como descrito acima.
- Dosagem de células-sialidase digerida KG1a rolando no IL-1β estimulada HBMEC-60. KG1a células pré-tratadas com 0.1U/ml Vibrio cholerae neuraminidase de 1hr a 37 ° C foram preparados e injetado na câmara de fluxo mais viver IL-1β estimulada HBMEC-60 conforme descrito acima.
- Dosagem de célula protease-digerida KG1a rolando no IL-1β estimulada HBMEC-60. KG1a células pré-tratadas com protease, 0.2U/ml Bromelain de 1h a 37 ° C, foram preparados e injetado na câmara de fluxo mais viver IL-1β estimulada HBMEC-60 conforme descrito acima.
6. Análise do NIS Elements-Cells KG1a Capturado e gráficos de Cell KG1a Dados do Rolling
- Após seqüência de tempo é adquirido, salvar os dados.
- Ir para "medir" a guia na barra de menu e selecione "definir limite." Mover barras de modo que as células desejadas são coloridos em vermelho. Selecione "todas as imagens" e depois "Ok". A seqüência de lapso de tempo inteiro deve agora ser modificado com vermelho visível células de rolamento.
- Vá para "Medir" e selecione "restrições". (Restrições permitem ao usuário excluir objetos thresholded que não representam as células de rolamento. Isto é principalmente de fundo criado pela monocamada HBMEC-60.) Selecione "área" e min de entrada e os valores máximo para a área de células de rolamento. Repita este passo para "alongamento" e "circularidade".
- Selecione "medida" e selecione "criar binários usando restrições", e definir os valores de restrição para otimizar NIS Elements software de reconhecimento de células rolando em monocamada de células HBMEC-60.
- Voltar para "medir", selecione "Os dados de campo" e selecione "dados reset". Fechar este menu.
- Retorno à "Medida" e SEselecione "campo scan".
- "Medida" aberto "; Os dados de campo", selecione "número ou Objects" e selecione "todos os campos" e exportar dados para o Microsoft Excel.
- Selecione "dados claros" para preparar-NIS Elements aquisição de células para a coleta de dados seguinte.
Resultados:
Figura 3. Parallel Plate-Análise Câmara Fluxo de E-selectina-Binding Atividade em Células KG1a. KG1a células tratadas com sialidase ou protease foram analisados para rolar a eficiência em monocamadas de HBMEC-60 células pré-tratadas com IL-1β. Controle negativo rolando experimentos também foram realizados por meio da análise de células KG1a rolando sobre a não-IL-1β estimulada HBMEC -60 células ou IL-1β estimulada HBMEC-60 células tratadas com anti-humano neutralizando E-selectina Moab (5D11). Freqüências de rolamento de células foram realizadas em triplicata e analisados com NIS Elements software. (Significância estatística *, p <0,001)
Neste relatório, baseado em vídeo, nós fornecemos uma representação visual de como analisar leucócitos - células endoteliais interações fisiológicas sob condições de estresse de cisalhamento. Em particular, analisamos o papel da E-selectina - E-selectina ligantes na mediação tethering leucócitos e rolando, um comportamento adesivo necessário para o compromisso do ensino secundário mais estável atividades de ligação através de receptores, como integrinas e receptores de ácido hialurônico. Usando a câmara de fluxo de placas paralelas adaptada para uso com um microscópio invertido, bomba de Harvard Seringa, câmera de vídeo e computador / celular de aquisição de hardware, realizamos experimentos em que E-selectina ligante + células KG1a foram usados como nosso modelo de leucócitos e células hBMEC (HBMEC- 60) estimuladas com citocinas pró-inflamatórias, IL-1β, foram usados como o nosso E-selectina modelo de células endoteliais humanas + (1-6). Como relatado anteriormente, observamos células KG1a robusta rolando no IL-1β estimulada HBMEC-60 células em um intervalo de níveis de tensão de cisalhamento de uma maneira E-selectina-dependente (Figura 3) (diferença estatisticamente significativa quando comparada com células KG1a rolando no não-IL-1β HBMEC-60 estimulou as células). Controles negativos, que consistia em KG1a célula rolando sobre a não-IL-1β estimulada HBMEC-60 em células ou IL-1β estimulada HBEMC-60 células pré-tratadas com mAb anti-humano E-selectina, foram realizados em paralelo para demonstrar a dependência de estimulação de citocinas e E-selectina expressão para a atividade de rolamento (Figura 3). Além disso, análise de rolamento de células pré-tratadas com KG1a Vibrio cholerae neuraminidase (sialidase) ou com bromelina, uma protease não específica conhecida para digerir superfície E-selectina glicoproteína ligante, destacou a importância dos resíduos de ácido siálico terminais e glicoproteína de superfície de E-selectina ligante atividade (2,3).
Discussion
De placas paralelas análise câmara de fluxo é uma empresa especializada sistema in vitro utilizado para estudar leucócitos - interações adesivas endoteliais sob condições de estresse de cisalhamento semelhantes aos transmitidos na superfície de uma vênula pós-capilar. Tal como é descrito aqui, em nossa apresentação visual, que demonstram o valor deste sistema para investigar o papel da E-selectina - E-selectina ligantes na mediação tethering leucócitos e rolando sobre a superfície do endotélio microvascular ativado. Nós também revelam a aplicação de glicosidase protease, e os tratamentos de anticorpos bloqueadores para elucidar o papel da E-selectina e seus ligantes neste sistema. Estas análises são altamente reprodutíveis e ajudar a formar uma base experimental para o estudo de E-selectina - E-selectina função de ligante in vivo.
Além de estudar a adesão celular com monocamadas de citocinas ativadas células endoteliais microvasculares (veia umbilical hBMEC ou humanos ou células endoteliais microvasculares dérmicas), os ensaios podem ser realizados utilizando humana recombinante purificada E-selectina ou E-selectina-Ig moléculas quiméricas como substrato de adesão celular. Interações outro adesivo mediada por leucócitos (L)-selectina e de plaquetas (P)-selectina também podem ser analisadas utilizando-placa paralela tecnologia de câmara de fluxo. Variando o tipo de substrato celular monocamada / proteína ou de leucócitos de entrada / modelos-selectina transfectant célula, os pesquisadores podem estudar o papel dessas interações sob condições de estresse fisiológico de cisalhamento.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse ou divulgações.
Acknowledgments
Financiamento para esse projeto foi fornecida por um prêmio da Sociedade Americana de Câncer Research Scholar, (06-024-01-CSM para Charles J. Dimitroff), um dos Institutos Nacionais de Saúde / Instituto Nacional do Câncer de subvenção (RO1CA118124 para Charles J. Dimitroff) e um dos Institutos Nacionais de Saúde / Instituto Nacional de Artrite e Doenças músculo-esqueléticas e da pele de subvenção (P30 AR042689 o Dr. Thomas S. Kupper; Hospital Brigham and Women de Boston, MA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178-500ML | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| 0.5 M EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 15575-038 | |
| 1M HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| Parallel-Plate Flow Chamber Kit | GlycoTech | 31-001 | |
| PHD2000 Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| 35x10mm Tissue Culture Dish | BD Biosciences | 353001 | |
| Fibronectin , from human plasma | Sigma-Aldrich | 86088-83-7 F2006-2MG | |
| Interleukin-1_, Human; Recombinant | Sigma-Aldrich | I9401-5UG | |
| HBSS (Hank s Buffered Saline Solution) | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| Medium 199 w/ HEPES & Glutamine | Invitrogen | 12320-039 | |
| Human Serum | Innovative Research, Inc. | IPLA-SER1 | |
| Heparin | Abraxis BioScience | 504011 | |
| Recombinant human fibroblast growth factor | R&D Systems | 233-FB | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Plastic Test tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Anti-human E-selectin clone BBIG-E4(5D11) | R&D Systems | BBA16 | |
| Bromelain | Sigma-Aldrich | B-4882 |
References
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