Summary
Dieser Bericht liefert eine visuelle Darstellung der parallelen Platten Flusskammer Analyse für das Studium Leukozyten Endothel-Interaktionen unter physiologischen Schubspannung. Diese Methode ist besonders nützlich für die Untersuchung der Rolle der endothelialen (E)-Selektin und Leukozyten-E-Selektin-Liganden, die Trigger-Leukozyten-Rollen auf Endothelzellen Oberflächen.
Abstract
E-Selektin ist ein Typ-1-Protein auf mikrovaskuläre Endothelzellen, initiieren Rekrutierung von zirkulierenden Leukozyten an Haut-, Knochen-und entzündetem Gewebe hilft. E-Selektin-Expression ist konstitutiv für die Haut und Knochen Mikrogefäßen und induzierbar ist durch pro-inflammatorische Zytokine wie IL-1α / und TNF-α, auf Mikrogefäßen in entzündetem Gewebe. Das Lektin Rezeptor vermittelt schwache bindende Wechselwirkungen mit Kohlenhydrat-Zähler-Rezeptor-Liganden auf zirkulierenden Leukozyten, die in einem charakteristischen Abrollverhalten führt. Da diese Wechselwirkungen stabiler Kleber Veranstaltungen und Diapedese Aktivität, Charakterisierung von Leukozyten-Rolling-Aktivität und Identifizierung von Leukozyten E-Selektin-Liganden voraus haben große Ziele in Studien von Leukozyten Menschenhandel und Entzündungen sowie bei der Entwicklung von entzündungshemmenden Therapien (1-5) wurden . Die Absicht dieses Berichts ist es, ein visuelles, umfassende Beschreibung der am häufigsten eingesetzte Technologie für das Studium von E-Selectin E-Selektin-Ligand-Wechselwirkungen unter physiologischen Blutfluss Bedingungen zu gewährleisten. Unser Labor in Verbindung mit der Harvard Skin Disease Research Center nutzt eine state-of-the-art parallel-plate Flusskammer Apparat durch digitale Visualisierung und neue Recording-Software, NIS-Elements begleitet. Diese Technologie ermöglicht es uns, Haftung Ereignisse in Echtzeit auf dem Bildschirm für die Visualisierung sowie Rekord rollenden Tätigkeit in einem Video-Format zu analysieren. Zelladhäsion Parameter, wie z. B. Walzen Frequenz, Scherfestigkeit und Bindung / Anbindehaltung Effizienz, mit NIS-Elements Software berechnet, exportiert nach einer Excel-Tabelle und einer statistischen Analyse. In der Demonstration hier vorgestellten beschäftigten wir die Parallel-Platten-Flusskammer an E-Selektin-abhängigen Leukozyten-Rolling Aktivität auf lebenden menschlichen Knochenmark Endothelzellen (HBMEC) zu untersuchen. Humanen hämatopoetischen Vorläuferzellen KG1a Zellen, die ein hohes Maß an E-Selektin-Liganden exprimieren, wurden wie unsere Leukozyten-Modell verwendet, während einer immortalisierten HBMEC Zelllinie, HBMEC-60-Zellen, wie unsere Endothelzellen-Modell (6) verwendet wurde. Zu induzieren und zu simulieren nativen E-Selektin-Expression in der Strömungskammer, HBMEC-60-Zellen wurden zunächst mit IL-1 aktiviert. Unsere Video-Präsentation zeigte, dass Parallel-Platten-Flow-Analyse ist eine geeignete Methode zur Untersuchung von physiologischen E-Selektin-vermittelte Leukozyten-Rolling-Aktivitäten und die funktionelle Charakterisierung von Leukozyten-E-Selektin Ligand (en) in der Strömungskammer kann festgestellt werden, durch die Umsetzung Protease oder Glycosidase Aufschlüsse.
Protocol
1. Vorbereitung der HBMEC (HBMEC-60 Cell) Monolayer auf Petrischalen für Flusskammer
- Coat 35 x 10mm Gewebe-Kulturschalen mit 2 ml 20μg/ml Fibronektin (in PBS) über Nacht bei 4 ° C oder 3 Stunden bei 37 ° C.
- Saugen Sie Fibronektin-Lösung von Speisen und müssen 1,5 x10 5 HBMEC-60-Zellen [Medium 199 mit HEPES & Glutamin, 10% FBS, 10% menschlichem Serum, 5 Einheiten / ml Heparin, 1ng/ml rekombinanten humanen Fibroblasten-Wachstumsfaktor, 1% Penicillin- Streptomycin], um das Gericht und ihnen zu erlauben, um> 90% Konfluenz wachsen. (Dies dauert 2 Tage)
- Absaugen Wachstum Medien und auf bis zu regulieren E-Selektin-Expression, fügen Sie frisches Medium mit IL-1β 50ng/mL für 4-6 Stunden. Zellmonoschichten sind nun bereit für das Walzen-Assay. Um E-Selektin Funktionsblock, neutralisierende Anti-Human-E-Selektin moAk (Klon BBIG-E4 (5D11)) kann bei 20μg/ml für ~ 1 Stunde bei 37 ° C.
2. Vorbereitung von humanen hämatopoetischen Vorläuferzellen KG1a Cells für Flusskammer
- Humanen hämatopoetischen Vorläuferzellen KG1a Zellen bis zur Konfluenz gewachsen (1x10 6 Zellen / ml) in RPMI-1640 mit Glutamin und 10% FBS / 1% Penicillin-Streptomycin und werden direkt aus der Flasche für den Einsatz in Flusskammer Assay pipettiert.
- Die Zellzahl wird mit Hilfe eines Hämozytometers und dann Zellen werden bei 1 x 10 6 Zellen / ml in HBSS mit 10 mM HEPES (H / H-Puffer) und 2 mM CaCl 2 resuspendiert
- Die Zellen werden auf Eis bis zur Verwendung in Test gespeichert.
3. Vorbereitung der Microscope, Parallel-Plate Flusskammer und Spritzenpumpe (Abbildung 1)
Abbildung 1. Illustration von Parallel-Plate Flusskammer Analysis. Inversen Mikroskop, Harvard Spritzenpumpe, Computer / Kamera-und Parallel-Platten-Flusskammer sind in eine optimale Anordnung für eine effiziente und reproduzierbare Zellanalyse platziert.
- Schalten Sie die Stromversorgung und Lichtquelle, um inverse Mikroskop und Macht Spritzenpumpe und wählen Sie den 10X-Objektiv am Mikroskop.
- Legen Sie 50 mL konischen Rohr im Halter und füllen sich mit H / H und 2 mM CaCl 2.
- Legen Sie 5ml Kunststoff Reagenzgläser in Reagenzglas Halter unterhalb der 50 mL konischen Rohr
- Legen Sie 60 ml Spritze in Spritzenpumpe (Achten Sie darauf, dass sowohl die Kolben und Körper der Spritze sowohl gesichert sind).
- Bringen Sie 3-Wege-Hahn an der 60 ml Spritze Ende und bringen 5ml-Spritze, um 3-Wege-Hahn.
- Legen Parallel Flusskammer Geräten (GlycoTech, Inc.) auf Mikroskop-Bühne mit Eingang Rohr auf der rechten Seite, Endröhre nach links und Vakuumröhrenkollektoren auf dem Rücken.
- Bringen Sie Vakuumschlauch auf Vakuum-und Open-Air-Ventil, damit parallel Plattenapparat auf die Bühne zu halten. (Diese Tests, wenn das Vakuum Rock auf der Flusskammer ist luftdicht.) Schalten Sie das Luftventil.
- Bringen Ausgang Rohrleitung (links von Mikroskop) zu 3-Wege-Hahn. Gerät ist jetzt für die Platzierung auf HBMEC-60 Monoschicht Platte vorbereitet.
- Legen Sie HBMEC-60 Monoschicht Platte und am Zentrum von Mikroskop.
- Schalten Sie Vakuum und die Position der Flusskammer Apparat oberhalb der Platte, so dass die Monoschicht Platte in der Mitte ist.
- Senken Sie die Flusskammer Apparat auf die HBMEC-60 Monoschicht Platte und lassen Flusskammer Gerät zum Absaugen unten. (Es sollte keine Geräusche der Luft entweicht und an diesem Punkt müssen Sie möglicherweise den Druck an die Kammer wenden, um die Gummidichtung zu komprimieren.)
- Sobald Vakuum hergestellt wurde, statt Input Rohr (rechts) in der 50ml konische Röhrchen mit H / H mit 2 mM CaCl 2.
- Offene 3-Wege-Hahn fließen in die 60 ml Spritze und Ort Pumpe in allow "Pumpe-Modus."
- Um Luft aus Input / Output-Linien, ohne den Zellen auf der Platte, verwenden Sie die Spritzenpumpe auf 2mL/minute Satz an das Ansaugrohr zu füllen, dann schnell auf 0,5 ml / Minute, kurz bevor die Flüssigkeit das Gerät gelangt. Es ist zwingend notwendig, um prime dieser Einrichtung sorgfältig und vermeiden Sie Luftblasen, die die Monoschicht von der Platte heben.
- Sobald Flüssigkeit gesehen, in der 60ml Spritze, die Strömungskammer und Spritzenpumpe bewegen wurden grundiert und der Flow Kammer ist einsatzbereit. Dieser Aufbau wird für jede Zelle Eingang laufen und für jede neue Platte benötigt wiederholt werden.
4. Capturing Leukocyte Rollende Events mit NIS Elements
- Öffnen Sie NIS Elements auf dem Desktop.
- Drücken Sie "Play"-Symbol für Live-Bild. Automatische Belichtung können Sie sehen, die Platte leichter ab und ist für die Fokussierung wichtig.
- Seien Sie sicher, dass Mikroskop ordnungsgemäß auf dem Zellmonolayer konzentriert.
- Einmal konzentriert, neu eingestellt Exposition gegenüber 1 Bild / s und stellen Sie Licht am Mikroskop. Das Bild sollte auf dem Computer angezeigt und nicht mehr im Mikroskop sichtbaren Sucher aufgrund der geringen Lichtstärke. Licht-Histogramm können dann ad werdenjusted zu Hintergrundbelastung zu entfernen oder zu verbessern Zelle Klarheit.
- Klicken Sie auf 2X2 bin oder Live Bin auf Bild, das sich ideal für Filmaufnahmen zu erhalten
- Klicken Sie auf "Makro" in der Menüleiste und wählen Sie "write to port"; wählen port "COM3" und "offen". (Dies öffnet den Port mit der Spritzenpumpe zu koordinieren.
- Pipette 1ml von KG1a Zellsuspension in die 5ml Reagenzglas in der Nähe des Eingangs Rohrleitung und setzen Sie dann Eingabe Schlauchleitung auf den Boden des Röhrchens.
- Zum Menüleiste auf "Capture" klicken, "Zeitraffer-Akquisition."
- Ein neues Menü erscheint. Wählen Sie das Protokoll dauerhaften 210 Sekunden, das ist die Länge des Programms für das Abrollen auf HBMEC-60-Zellen. (Jede Phase ist so programmiert, dass ein Bild pro Sekunde für die Dauer der Pumpe-Protokoll. Es ist auch bis zu einem Befehl über die COM3-Port, um die Pumpe zu starten senden eingestellt.) Wenn Zeitraffer unterbrochen wird, wird die Pumpe nicht zu stoppen auf eigene und müssen zurückgesetzt werden. Drücken Sie auf Abbrechen, um zurück zur Bilder-leben.
- Stellen Sie die Spritzenpumpe auf "Program Mode" nach Anleitung. (Programm-Modus ermöglicht die manuelle Programmierung von spezifischen Durchflussraten (dh Schubspannung Ebenen) innerhalb der Kammer mitgeteilt werden und diktieren KG1a Zell-Interaktionen über die HBMEC-60 Zellmonolayer.) Einstellungen für KG1a Zellrollen auf HBMEC Die Zellen wurden wie folgt 4,2 Dyn / cm 2 für 45 s, 0,3 Dyn / cm 2 für 60 s, und schrittweise erhöht alle 15 s eine maximale von 4,2 dyn / cm 2
- Wandschubspannung (W st) in der Kammer wurde nach folgender Formel berechnet: W st = 6μQ / a 2 b, wo μ die geschätzte Viskosität der Medien (0,0076 P) ist, Q den Volumenstrom in ml / ist s, ist eine der Kanalhöhe (Dichtungsdicke) in cm (0,03 cm), und b ist die Kanalbreite in cm (0,5 cm). Volumenströme geregelt waren mit dem Programm-Modus der Spritzenpumpe.
- Mikroskop und Computer sind nun bereit, Zeitraffer-Fotografie zu erfassen. Drücken Sie auf "Start Ausführen" auf dem Computer zu beginnen Erfassung von Daten. Während der Ausführung des Programms darauf, dass die Medien in das Reagenzglas mit KG1a Zellen hinzufügen, um immer die Input / Output-Schlauch voller Medium (Stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblasen).
5. Die Abhängigkeit von Terminal Sialylierung und Oberflächenglykoprotein für E-Selektin-vermittelte KG1a Cell 5. Rolling (Abbildung 2; Videos Clips von 5,1 bis 5,5)
- Testen von KG1a Zellrollen auf nicht-stimulierten HBMEC-60-Zellen. (Negative Kontrolle) KG1a Zellen wurden hergestellt und infundiert in die Strömungskammer über Live-nicht-IL-1β-stimulierten HBMEC-60 wie oben beschrieben.
- Testen von KG1a Zellrollen auf HBMEC-60-Zellen mit IL-1β vorbehandelt. (E-Selektin-Abhängigkeit control) KG1a-Zellen hergestellt wurden und in die Strömungskammer über infundiert leben IL-1β-stimulierten HBMEC-60 wie oben beschrieben.
- Testen von KG1a Zellrollen auf HBMEC-60-Zellen mit IL-1β und dann neutralisieren Anti-Human-E-Selektin Moab. (E-Selektin-Abhängigkeit control) KG1a Zellen wurden hergestellt und in die Strömungskammer über Live infundiert IL-vorbehandelten 1β-stimulierten HBMEC-60 vorbehandelt mit neutralisierenden Anti-Human-E-Selektin moAk wie oben beschrieben.
- Testen von Sialidase-verdaut KG1a Zellrollen auf IL-1β-stimulierten HBMEC-60. KG1a Zellen vorbehandelt mit 0.1U/ml Vibrio cholerae Neuraminidase für 1 Stunde bei 37 ° C wurden vorbereitet und in die Strömungskammer über infundiert leben IL-1β-stimulierten HBMEC-60 wie oben beschrieben.
- Testen von Protease-verdauten KG1a Zellrollen auf IL-1β-stimulierten HBMEC-60. KG1a Zellen vorbehandelt mit Protease wurden 0.2U/ml Bromelain für 1 Stunde bei 37 ° C, vorbereitet und in die Strömungskammer über infundiert leben IL-1β-stimulierten HBMEC-60 wie oben beschrieben.
6. Die Analyse der NIS-Elements-Captured KG1a Cells und grafische Darstellung von KG1a Zellrollen Daten
- Nach Zeitablauf erworben wird, die Daten zu speichern.
- Gehe zu "messen" Lasche auf Menüleiste und wählen Sie "define Schwelle." Bewegen Sie Bars, so dass gewünschten Zellen sind rot gefärbt. Wählen Sie "alle Bilder", dann "Okay". Die gesamte Zeitraffer-Sequenz sollte nun mit sichtbaren roten rollenden Zellen modifiziert werden.
- Zum "Messen" und wählen Sie "Einschränkungen". (Einschränkungen erlauben dem Benutzer, Schwellenwert Objekte, die nicht repräsentieren rollenden Zellen auszuschließen. Dies ist in erster Linie Hintergrund der HBMEC-60 Monoschicht erstellt.) Wählen Sie "Bereich" und geben Sie Minimal-und Maximalwerte für den Bereich für das rollende Zellen. Wiederholen Sie diesen Schritt für "Dehnung" und "Rundheit".
- Wählen Sie "Messen" und wählen Sie "erstellen binäre mit Einschränkungen", und stellen Sie die Einschränkung Werte NIS-Elements-Software Anerkennung des rollenden Zellen auf Monolage HBMEC-60-Zellen zu optimieren.
- Gehen Sie zurück zu "messen", wählen Sie "Felddaten", und wählen Sie dann "Daten zurücksetzen". Dieses Menü schließen.
- Zurück zu "Measure" und seSelect "Scan-Feld".
- Öffnen Sie "Messen", "Field-Daten", wählen Sie "Nummer oder Objekte" und wählen Sie dann "alle Felder" und Export von Daten in Microsoft Excel.
- Wählen Sie "Löschen von Daten" auf NIS-Elements Zelle Übernahme für die nächste Datenerhebung vorzubereiten.
Ergebnisse:
Abbildung 3. Parallel-Plate Flusskammer Analyse von E-Selektin-bindenden Aktivität auf KG1a Cells. KG1a Zellen mit Sialidase oder Protease behandelt wurden Rollwiderstand auf Monoschichten von HBMEC-60-Zellen mit IL-1β vorbehandelten analysiert. Negative Kontrolle rollenden Experimente wurden auch durch die Analyse KG1a Zellrollen auf nicht-IL-1β-stimulierten HBMEC -60 Zellen oder IL-1β durchgeführt stimulierten HBMEC-60-Zellen mit neutralisierenden Anti-Human-E-Selektin moAk (5D11) behandelt. Zellrollen Frequenzen wurden dreifach durchgeführt und analysiert mit NIS-Elements-Software. (* Statistische Signifikanz: p <0,001)
In diesem Video-basierten Bericht, sofern wir eine visuelle Darstellung, wie Leukozyten-Analyse - endothelialen Zell-Wechselwirkungen unter physiologischen Schubspannung Bedingungen. Insbesondere untersuchten wir die Rolle von E-Selektin - E-Selektin-Liganden bei der Vermittlung von Leukozyten Tethering und Rollen, einen Kleber Verhalten notwendig Engagement der sekundären stabilere Bindung Aktivitäten durch Rezeptoren, wie Integrine und Hyaluronsäure-Rezeptoren. Mit dem Parallel-Platten-Flusskammer für die Verwendung mit einem inversen Mikroskop, Harvard Spritzenpumpe, Videokamera und Computer / Zelle Erwerb Hardware angepasst, führten wir Experimente, bei E-Selektin-Ligand + KG1a Zellen wurden als unsere Leukozyten-Modell und HBMEC Zellen verwendet (HBMEC- 60) mit pro-inflammatorischen Zytokinen, IL-1β stimuliert wurden, wie unsere E-Selektin + humaner Endothelzellen-Modell (1-6) verwendet. Wie bereits berichtet, beobachteten wir robust KG1a Zellrollen auf IL-1β-stimulierten HBMEC-60-Zellen über einen Bereich von Schubspannung Ebenen in einer E-Selektin-abhängigen Weise (Abbildung 3) (statistisch signifikanter Unterschied, wenn sie mit KG1a Zellrollen auf Vergleich Nicht-IL-1β stimulierten HBMEC-60-Zellen). Negative Kontrollen, die von KG1a Zellrollen auf nicht-IL-1β-stimulierten HBMEC-60-Zellen oder aus IL-1β-stimulierten HBEMC-60-Zellen vorbehandelt mit Anti-Human-E-Selektin mAb, wurden parallel durchgeführt, um die Abhängigkeit zu demonstrieren von Zytokin-Stimulation und E-Selektin-Expression für das rollende Aktivität (Abbildung 3). Darüber hinaus rollt Analyse KG1a Zellen vorbehandelt mit Vibrio cholerae Neuraminidase (Sialidase) oder mit Bromelain, ein nicht-spezifische Protease für die Verdauung Oberfläche E-Selektin-Glycoprotein-Liganden bekannt, hob die Bedeutung der terminalen Sialinsäure-Reste und Oberflächenglykoprotein für E-Selektin-Liganden Aktivität (2,3).
Discussion
Parallel-Platten-Flusskammer Analyse ist eine spezielle In-vitro-Testsystem für die Untersuchung Leukozyten verwendet - endothelial adhäsive Wechselwirkungen unter Scherbeanspruchung ähnlichen Bedingungen wie denen auf der Oberfläche eines post-kapillaren venule vermittelt. Wie dargestellt hier in unserem visuellen Präsentation zeigen wir, den Wert dieses Systems für die Untersuchung der Rolle von E-Selektin - E-Selektin-Liganden bei der Vermittlung von Leukozyten Tethering und Rollen auf der Oberfläche von aktivierten mikrovaskulären Endothel. Wir zeigen auch die Anwendung von Protease, Glycosidase und blockierenden Antikörper-Behandlungen für die Aufklärung der Rolle von E-Selektin und seine Liganden in diesem System. Diese Analysen sind sehr gut reproduzierbar und helfen Form einer experimentellen Grundlage für die Untersuchung von E-Selectin - E-Selektin-Ligand-Funktion in vivo.
Neben dem Studium der Zelladhäsion mit Monoschichten von Zytokin-aktivierten mikrovaskulären Endothelzellen (HBMEC oder menschlichen Nabelvene oder dermalen mikrovaskulären Endothelzellen), können Tests durchgeführt unter Verwendung von gereinigtem rekombinantem humanem E-Selectin oder E-Selektin-Ig chimäre Moleküle als Substrat werden für die Zelladhäsion. Andere adhäsive Wechselwirkungen durch Leukozyten (L-)-Selektin und Thrombozyten (P)-Selektin kann auch untersucht unter Verwendung von parallelen Platten Flusskammer Technologie vermittelt. Durch Variation der Art der Zellmonolayer / Protein-Substrat oder der Eingang Leukozyten / Selektin-transfizierten Zelle Modellen, können die Ermittler die Rolle dieser Wechselwirkungen unter physiologischen Schubspannung Bedingungen zu studieren.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte oder Angaben.
Acknowledgments
Die Finanzierung für dieses Projekt wurde von einem American Cancer Society Research Scholar Award, (06 bis 024-01-CSM zu Charles J. Dimitroff) zur Verfügung gestellt, ein National Institutes of Health / National Cancer Institute gewähren (RO1CA118124 zu Charles J. Dimitroff) und eines Nationalen Institutes of Health / National Institute of Arthritis and Bewegungsapparates und Hautkrankheiten zu gewähren (P30 AR042689 zu Dr. Thomas S. Kupper, Brigham and Womens Hospital, Boston, MA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178-500ML | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| 0.5 M EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 15575-038 | |
| 1M HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| Parallel-Plate Flow Chamber Kit | GlycoTech | 31-001 | |
| PHD2000 Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| 35x10mm Tissue Culture Dish | BD Biosciences | 353001 | |
| Fibronectin , from human plasma | Sigma-Aldrich | 86088-83-7 F2006-2MG | |
| Interleukin-1_, Human; Recombinant | Sigma-Aldrich | I9401-5UG | |
| HBSS (Hank s Buffered Saline Solution) | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| Medium 199 w/ HEPES & Glutamine | Invitrogen | 12320-039 | |
| Human Serum | Innovative Research, Inc. | IPLA-SER1 | |
| Heparin | Abraxis BioScience | 504011 | |
| Recombinant human fibroblast growth factor | R&D Systems | 233-FB | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Plastic Test tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Anti-human E-selectin clone BBIG-E4(5D11) | R&D Systems | BBA16 | |
| Bromelain | Sigma-Aldrich | B-4882 |
References
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- Dimitroff, C. J., Descheny, L., Trujillo, N., Kim, R., Nguyen, V., Huang, W., Pienta, K. J., Kutok, J. L., Rubin, M. A. Identification of leukocyte E-selectin ligands, P-selectin glycoprotein ligand-1 and E-selectin ligand-1, on human metastatic prostate tumor cells. Cancer Res. 65, 5750-5760 (2005).
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