Summary
这份报告提供了一个平行板流动腔分析研究生理剪切应力下的白细胞内皮细胞相互作用的视像描划。调查的内皮细胞（E） - 选择素和白细胞E -选择素配体触发白细胞在血管内皮细胞表面滚动的作用，这种方法尤其有用。
Abstract
E -选择是对微血管内皮细胞1型膜蛋白，有助于启动的循环白细胞，皮肤，骨骼和发炎组织的招聘。 E -选择素的表达，是构成对皮肤和骨骼的微血管和促炎性细胞因子，如IL -1α/和TNF -α，微血管发炎组织，诱导。这种外源凝集素受体介导循环白细胞，在一个特点的滚动行为结果与碳水化合物的反受体配体结合的相互作用较弱。因为这些相互作用的胶更稳定的事件和diapedesis活动，白细胞滚动活动的特征和白细胞E -选择素配体识别之前已白细胞贩运和炎症的研究和消炎疗法发展的主要目标（1-5） 。本报告的目的是提供一个视觉生理血流条件下E -选择素E -选择素配体相互作用的研究最广泛使用的技术，全面的描述。我们的实验室与哈佛皮肤病研究中心一起，用一个国家的最先进的平行平板流动腔装置伴随着数字可视化和新的录音软件，NIS元素。这项技术使我们能够粘附在屏幕上的可视化，以及记录在视频格式的滚动活动实时事件分析。细胞粘附的参数，如滚动频率，抗剪和有约束力的效率/圈养的，NIS元素的软件计算，导出到Excel电子表格和统计分析。在这里介绍的示范，我们采用的平行板流动腔调查现场人骨髓内皮细胞（HBMEC）E -选择素依赖的白细胞滚动活动。人类造血祖细胞KG1a细胞，表达高水平的E -选择素配体，被用来作为我们的白细胞模式，而一个永生HBMEC细胞株，HBMEC - 60细胞，内皮细胞模型（6）。诱导和模拟原生E -选择素的表达，在流室HBMEC - 60细胞与IL - 1激活。我们的视频演示表明，平行板流分析是一个适合学习生理E -选择素介导的白细胞滚动活动和白细胞E -选择素配体（S）的功能特性在流动腔的方法，可确定实施蛋白酶或糖苷酶消解。
Protocol
1。 HBMEC制备单层（HBMEC - 60细胞）在培养皿流室
- 大衣35 x 10mm的组织培养皿在372毫升20μg/ml纤维连接蛋白（在PBS）在4℃过夜，或为3小时° C。
- 吸菜纤维连接蛋白的解决方案，并添加 5 HBMEC 1.5 X10 - 60细胞[中199 HEPES及谷氨酰胺，10％胎牛血清，10％的人血清，5个单位/ ml肝素，1ng/ml重组人成纤维细胞生长因子， 1％青霉素链霉素]的菜，让他们成长到90％汇合。 （2天）
- 吸生长介质，并上调E -选择素的表达，增加与50ng/mL的IL -1β的新鲜培养基为4-6小时。细胞单层现在准备滚动检测。要阻止E -选择素的功能，中抗人E -选择素单克隆抗体（克隆BBIG - E4（5D11））可以添加在37〜1小时，在20μg/ml° C。
2。人体造血祖流室KG1a细胞的制备
- 人体造血祖KG1a细胞生长至汇合（1 × 10 6细胞/ ml）的RPMI - 1640谷氨酰胺和10％FBS / 1％的青霉素，链霉素和吸管直接从烧瓶在流动腔实验中使用。
- 细胞数计算hemacytometer使用，然后在1 × 10 6细胞/ ml的细胞重新悬浮在10MM HEPES（H / H缓冲液）和2mm氯化钙2的HBSS
- 存储在冰块，直到在实验中使用的细胞。
3。制备显微镜，平行板流动腔和注射泵（图1）
图1平行板流动腔分析的插图。倒置显微镜，哈佛注射泵，计算机/摄像机和平行板流动腔放置在效率和可再生的细胞分析的最佳安排。
- 倒置显微镜和微量注射泵的电源，并打开电源和光源选择在显微镜10X目的。
- 在持有人与H / H和2mm 氯化钙 50毫升锥形管和填充。
- 下面的测试50ml的锥形管的管持有人将5毫升塑料试管
- 放置在60ml的注射器注射泵（务必注射器的柱塞和身体都担保）。
- 将3路停止公鸡结束60ML注射器5ml注射器和附加3路停止公鸡。
- 广场平行流商会仪器显微镜阶段（GlycoTech公司）与输入管的权利，输出管的左侧和真空集热管的背部。
- 将真空管真空和空气阀打开，让平行板器具坚持阶段。 （如果流室的真空裙是气密试验。）关闭气阀。
- 将输出管行（显微镜左）3路停止公鸡。仪器正准备投放HBMEC - 60单层板。
- 广场HBMEC - 60单层板并将其放置在显微镜中心。
- 打开真空和位置以上的单层板在中心板流动腔装置。
- 轻轻地降低到HBMEC - 60单层板流室装置，并允许流室装置吸。 （应该有逃逸的空气没有的声音，在这一点上，你可能需要施加压力，以商会压缩橡胶垫片。）
- 一旦真空已经成立，地方输入管（右）含H / H 2mm的氯化钙2到50毫升锥形管。
- 打开三路停止公鸡，让流“到60ml的注射器和地方泵泵模式。”
- 要删除不解除对板细胞的输入/输出线中的空气，使用注射泵2mL/minute设置，以填补进管，然后迅速设置为0.5毫升/分钟之前的流体达到仪器。当务之急是总理此设立小心，避免气泡，将取消单层板。
- 一旦液体被视为迁入60毫升注射器，流室，注射泵已准备使用底漆和流动室。此设置将重复每个单元格输入运行和需要为每个新盘。
4。捕获使用NIS元素的白细胞滚动事件
- 打开桌面上的NIS元素。
- 按“播放”图标实时图像。自动曝光，将让你看到的板现在更容易，是重要的重点。
- 确定，重点是正确的单层细胞显微镜。
- 一旦集中，重新设置曝光，以1帧/秒，并调整显微镜的光。图像应出现在电脑上，不再由于微光显微镜取景器中可见。光直方图然后可以广告justed删除背景曝光，或提高细胞的清晰度。
- 2X2 bin或现场斌点击获取图片，录像拍摄的理想选择
- 点击菜单栏上的“宏”，并选择“写端口”，端口选择COM3“，”和“开放”。 （这将打开的端口，以配合注射泵。
- 移液器1ML KG1a细胞悬液到附近的输入管行5毫升试管，然后将输入管行试管底部。
- 转到菜单栏，点击“捕获”，“时间推移的收购。”
- 会弹出一个新的菜单。选择协议持续210秒，这是HBMEC - 60细胞上滚动的程序的长度。 （编程的每一个阶段是拍照每秒钟泵的协议的期限，这也是成立COM3端口，启动水泵，通过发送命令。）如果中断时间推移，泵不会停止自身必须复位。按一下“取消”返回到实时图像。
- 根据说明书设置注射泵“计划模式”。 （编程模式允许特定的流速（即剪应力水平）传授内室和KG1a细胞间的相互作用决定在HBMEC - 60细胞单层的手工编程。）滚动HBMEC细胞对KG1a细胞的设置如下：4.2达因厘米2 / 45秒，0.3达因/厘米2 60秒，并逐步增加每15秒最多4.2达因/厘米2
- 在会议厅内的壁面切应力（ 宽街）按下列公式计算：ST =6μQ/ A 2 B，其中μ是媒体的估计粘度（0.0076 P），Q是在ML的体积流量/ S，A通道的高度，以厘米（垫片的厚度）（0.03厘米），和B是在厘米（0.5厘米）的通道宽度。流量调节注射泵的使用程序模式。
- 显微镜和计算机现正准备捕捉延时拍摄。按“开始运行”，在计算机上开始采集数据。程序运行时，请务必将媒体添加到包含KG1a细胞的试管中，以保持充满介质的输入/输出管（确保没有气泡）。
5。终端Sialylation和E -选择素介导的KG1a细胞的表面糖蛋白依赖性。轧件（图2 5.1-5.5视频剪辑）
- 含量的KG1a滚动细胞无刺激HBMEC - 60细胞（阴性对照）KG1a细胞注入到流室超过生活非IL -1β刺激的HBMEC - 60如上所述。
- 测定KG1a细胞滚动HBMEC - 60与IL -1β前处理的细胞（E -选择依赖控制）KG1a细胞注入到流室超过现场的IL -1β刺激的HBMEC - 60如上所述。
- KG1a细胞测定HBMEC - 60细胞的轧前处理的IL -1β，然后中和抗人E -选择素（E -选择依赖控制 ）单克隆抗体。KG1a细胞准备和在实况流室注入IL - 1β刺激的HBMEC - 60如上所述，中抗人E -选择素单克隆抗体的预处理。
- 唾液酸酶的消化KG1a滚动细胞测定IL -1β刺激的HBMEC - 60。 0.1U/ml霍乱弧菌神经氨酸酶为1小时37℃预处理KG1a细胞的制备和注入流动室以上住白细胞介素-1β刺激的HBMEC - 60如上所述。
- 蛋白酶消化KG1a滚动细胞测定IL -1β刺激的HBMEC - 60。 KG1a细胞与蛋白酶处理，0.2U/ml菠萝蛋白酶在37 ° C为1小时，准备和注入流动腔超过实时的IL -1β刺激HBMEC - 60如上所述。
6。 NIS元素拍摄的KG1a细胞KG1a细胞的图形滚动数据分析
- 时间序列收购后，保存数据。
- 转到菜单栏上的“测量”选项卡，选择“定义的门槛。”移动所需的细胞，使红色的酒吧。选择“所有图像”，那么“好”。整个时间推移的顺序，现在应该修改可见红色的滚动细胞。
- 转到“办法”，并选择“限制”。 （限制地允许用户排除阈值的对象，并不代表滚动细胞，这主要是由HBMEC - 60单层创建的背景。）选择“区”，输入最小值和最大值滚动细胞领域。重复这一步“伸长”和“圆”。
- 选择“测量”，并选择“创建二进制使用限制”，并设定限制值HBMEC - 60细胞单层优化NIS元素滚动细胞的软件识别。
- 回到“测量”，选择“现场数据”，然后选择“复位数据”。关闭此菜单。
- “办法”和SElect“扫描领域”。
- 打开“测量”，“现场数据”，选择“数量或对象”，然后选择“各个领域”，将数据导出到Microsoft Excel。
- 选择“清除数据”，以准备下一个数据收集NIS元素细胞采集。
结果：
图3平行平板流动商会分析，E -选择约束力的KG1a细胞的活动。唾液酸酶或蛋白酶处理的KG1a细胞上滚动HBMEC - 60与IL -1β前处理的细胞单层效率进行了分析。负控制轧制实验还进行了分析KG1a细胞对IL -1β刺激的HBMEC -60细胞或滚动的IL -1β刺激的HBMEC - 60细胞中和抗人E -选择素单克隆抗体（5D11）治疗。细胞滚动频率分别为一式三份，并与NIS元素软件分析。 （*统计意义，P <0.001）
在此视频为基础的报告，我们提供的可视化描述了如何分析白细胞 - 生理剪应力条件下的内皮细胞的相互作用。特别是，我们分析了E -选择素的作用 - E -选择素配体介导白细胞圈养及压延，粘合剂行为必要的承诺，通过整合和透明质酸受体的受体，如中学更稳定的结合活动。我们使用的平行板流动腔倒置显微镜，哈佛注射器泵，视频摄像机和计算机/细胞采集硬件使用改编，进行实验，其中E -选择素配体+ KG1a细胞是我们的白细胞模型和HBMEC细胞使用（HBMEC - 60）与促炎性细胞因子，IL -1β的刺激下，分别用E -选择素+人血管内皮细胞模型（1-6）。据此前报道，我们观察到强大的KG1a细胞滚动IL -1β刺激的HBMEC - 60细胞，通过一系列在E -选择素依赖性（图 3）（KG1a细胞上滚动时相比差异有统计学意义的剪应力水平非IL -1β刺激HBMEC - 60细胞）。阴性对照，其中包括对KG1a细胞对IL -1β刺激HBMEC - 60细胞或滚动IL -1β刺激HBEMC - 60细胞预处理的抗人E -选择素单克隆抗体，进行并行展示的依赖滚动活动的细胞因子刺激和E -选择素的表达（图3）。此外，滚动分析KG1a细胞预处理与霍乱弧菌神经氨酸酶（唾液酸酶）或与菠萝蛋白酶，非特异性蛋白酶消化表面E -选择素糖蛋白配体，强调E -选择素配体的末端唾液酸残基和表面的糖蛋白的重要性活动（2,3）。
Discussion
平行平板流动腔的分析是一种在体外检测系统专门用于研究白细胞 - 内皮粘合剂相互作用下剪应力条件相似传授那些表面的毛细血管后微静脉。正如在我们的视觉表现描绘，我们展示了这个系统的调查E -选择素的作用的价值 - E -选择素配体介导白细胞圈养和激活微血管内皮细胞的表面上滚动。我们也揭示蛋白酶，糖苷酶和阐明E -选择素及其配体在这个系统中的作用的封闭抗体治疗中的应用。这些分析是高度重现性好，有利于形成学习E -选择素的实验依据 - E -选择素配体在体内的功能。
此外，以研究细胞与细胞因子激活的微血管内皮细胞（HBMEC或人脐静脉或皮肤微血管内皮细胞）的单分子膜的附着力，可以用纯化的重组人E -选择或作为基材的E -选择素，免疫球蛋白嵌合分子检测细胞粘附。胶粘剂等的相互作用，通过白细胞介（L -型）选择和血小板（P）的选择，也可以使用平行板流动腔技术检测。通过改变细胞单层/蛋白底物的类型，或输入的白细胞/选择，转染的细胞模型，研究人员可以研究生理剪应力条件下的这些相互作用的作用。
Disclosures
作者有兴趣或披露任何冲突。
Acknowledgments
该项目的筹资提供了由美国癌症协会的研究学者奖（06 - 024 - 01 - CSM的查尔斯J Dimitroff）;国家机构的健康/美国国家癌症研究所资助（RO1CA118124查尔斯J. Dimitroff）;和国家卫生研究所/国家关节炎，肌肉骨骼及皮肤疾病授予的研究院（P30 AR042689托马斯博士S. Kupper;布里格姆与妇女医院，马萨诸塞州波士顿）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178-500ML | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| 0.5 M EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 15575-038 | |
| 1M HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| Parallel-Plate Flow Chamber Kit | GlycoTech | 31-001 | |
| PHD2000 Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| 35x10mm Tissue Culture Dish | BD Biosciences | 353001 | |
| Fibronectin , from human plasma | Sigma-Aldrich | 86088-83-7 F2006-2MG | |
| Interleukin-1_, Human; Recombinant | Sigma-Aldrich | I9401-5UG | |
| HBSS (Hank s Buffered Saline Solution) | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| Medium 199 w/ HEPES & Glutamine | Invitrogen | 12320-039 | |
| Human Serum | Innovative Research, Inc. | IPLA-SER1 | |
| Heparin | Abraxis BioScience | 504011 | |
| Recombinant human fibroblast growth factor | R&D Systems | 233-FB | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Plastic Test tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Anti-human E-selectin clone BBIG-E4(5D11) | R&D Systems | BBA16 | |
| Bromelain | Sigma-Aldrich | B-4882 |
References
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