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Microbiology

显微镜和染色:革兰克、胶囊和内孔染色

Overview

资料来源:Rhiannon M. LeVeque1, 纳塔利娅·马丁1,安德鲁·范阿尔斯特1,和维克托·迪丽塔1
1密歇根州立大学微生物学和分子遗传学系,美国密歇根州东兰辛分校

细菌是地球上几乎随处可见的各种微生物。许多特性有助于区分它们彼此,包括但不限于革兰染色类型、形状和排列、胶囊的产生和孢子的形成。为了观察这些特性,可以使用光显微镜;然而,一些细菌特性(例如尺寸、缺乏着色和折射特性)使得仅用光学显微镜(1,2)很难区分细菌。使用光显微镜区分细菌类型时,必须染色细菌。光学显微镜的两种主要类型是简单和复合的。它们之间的主要区别是用于放大物体的透镜数量。简单的显微镜(例如放大镜)只有一个镜头来放大物体,而复合显微镜有几个透镜来增强放大倍率(图1)。复合显微镜有一个接近物体的物镜,它收集光来创建物体的图像。然后,通过放大图像的目镜(目镜)放大。与单独使用单个镜头相比,将物镜和目镜相结合可实现更高的放大倍率。通常,复合显微镜具有多个不同功率的物镜,允许不同的放大倍率(1,2)。在这里,我们将讨论可视化细菌与革兰氏污渍,胶囊污渍,和内孔污渍。

Figure 1
图1:典型的复合显微镜。显微镜最重要的部分是标记的。

1884年由丹麦细菌学家汉斯·克里斯蒂安·格拉姆(1)开发的革兰氏染色剂根据细胞壁的组成(1,2,3,4)区分细菌。简单地说,细菌涂片被放置在显微镜幻灯片上,然后热固定,使细胞粘附在幻灯片上,使它们更容易接受污渍 (1)。热固定样品被水晶紫罗兰染色,使细胞变紫色。幻灯片用碘溶液冲洗,将水晶紫罗兰固定在细胞壁上,然后用去色剂(酒精)洗去任何非固定的水晶紫罗兰。在最后一步中,反伤,萨夫兰宁,被添加到彩色单元格红色(图2)。革兰氏阳性细菌由于厚厚的肽类层而染上紫色,而脱色剂不易渗透;革兰氏阴性细菌,其较薄的肽脂层和较高的脂质含量,与脱色剂脱色,并在添加Safranin时反染红色(图3)。革染用于将细胞区分为两种类型(革兰氏阳性和革兰氏阴性),还可用于区分细胞形状(球体或球菌、棒、弯曲棒和螺旋)和排列(单个细胞、对、链、组和簇)(1、3).

Figure 2
图2:革兰染色协议的原理图。左列显示革兰氏阴性细菌在协议的每一步的反应。右列显示革兰氏阳性细菌的反应。此外,所示是两个典型的细菌细胞形状:杆菌(或棒)和球菌(或球体)。

Figure 3
图 3:革兰克染色结果。金黄色葡萄球菌(革联-正紫色球菌)和大肠杆菌(革兰-阴性红棒)混合物的革兰氏染色。

有些细菌产生一个细胞外粘性外层,称为胶囊(3,5)。胶囊是具有各种功能的保护结构,包括但不限于粘附表面和其他细菌、防止干燥和防止噬菌体。胶囊通常由含有95%以上水的多糖组成,但有些可能含有多醇和多胺(5)。由于其大多非离子成分和排斥污渍的倾向,简单的染色方法不适用于胶囊;相反,胶囊染色使用负染色技术,污渍细胞和背景,留下胶囊作为一个明确的光环周围的细胞(1,3)(图4)。胶囊染色涉及将细菌样品涂抹在显微镜幻灯片上的酸性污渍中。与革兰染色不同,细菌污迹在胶囊染色期间不热固定。热固定可以破坏或脱水胶囊,导致假底片 (5)。此外,热固定可以收缩细胞,导致细胞周围的清除,可以误认为胶囊,导致误报(3)。酸性污渍使滑动背景变色;而跟进一个基本的染色,水晶紫罗兰,颜色的细菌细胞本身,离开胶囊不染色,并显示为细胞和滑动背景之间的一个明确的光环(图5)。传统上,印度墨水被用作酸性污渍,因为这些颗粒不能穿透胶囊。因此,胶囊和细胞都没有被印度墨水弄脏;相反,背景被染色。刚果红,尼格罗辛,或Eosin可用于代替印度墨水。胶囊染色可以帮助医生诊断细菌感染时,从患者样本看培养物,并指导适当的患者治疗。由封装细菌引起的常见疾病包括肺炎、脑膜炎和沙门氏菌病。

Figure 4
图4:胶囊染色协议原理图。顶部面板显示任何污渍应用前的幻灯片涂抹。中间面板显示幻灯片和细菌如何照顾主要污渍,刚果红。最后一个面板显示幻灯片和细菌如何照顾反污渍,水晶紫罗兰。

Figure 5
图5:胶囊染色结果。胶囊染色的封装的阿辛托细菌鲍曼尼(用黑色箭头表示)和非封装大肠杆菌(用白色箭头表示)。请注意,背景是黑暗的,A.鲍曼尼细胞是彩色紫色的。A. baumanni细胞周围的胶囊明显是光晕,而大肠杆菌没有光晕。

在不利条件下(例如营养限制、极端温度或脱水),一些细菌产生内孢子,代谢不活性结构,对物理和化学损伤具有抵抗力(1、2、8、9)。内孢子通过保护细胞的遗传物质,使细菌在恶劣的条件下存活;一旦条件有利于生长,孢子发芽,细菌生长继续。内孢子很难用标准染色技术染色,因为它们对通常用于染色的染料是不可渗透的(1,9)。通常用来染色内皮孢子的技术是舍弗-富尔顿法(图6),它使用主要染色马拉奇特绿,水溶性污渍,结合相对较弱的细胞物质和热量,使污渍打破通过孢子皮层(图7)。这些步骤为生长的细胞(在内窥镜生物学中称为植物细胞)以及内孢子和任何游取孢子(那些不再在前细胞包络中的孢子)着色。植物细胞用水洗涤,去除马拉奇特绿;内孢子保留污渍,由于加热马拉奇特绿色在孢子内。最后,植物细胞与萨夫兰宁进行反染色以进行可视化(图8)。内孢子的染色有助于将细菌分化为孢子前体和非孢子前体,并确定样品中是否存在孢子,如果存在,则可能导致细菌在发芽时受到污染。

Figure 6
图6:内孔染色协议原理图。左列显示孢子形成细菌在协议的每一步的反应。右列显示非孢子形成细菌的反应。

Figure 7
图7:内孔结构图。含有内分孔的细菌细胞,标有各种孢子结构。

Figure 8
图8:内孔染色结果。氏杆菌内皮孢子的典型染色。植物细胞(用白色箭头表示)被染成红色,而内孢子(用黑色箭头表示)被染成绿色。

Procedure

1. 革兰染色

  1. 设置
    1. 戴上手套和不可燃的实验室外套,因为染料会弄脏手和衣服。
    2. Bunsen 燃烧器用于加热修复细菌。使用火焰时要小心;绑回长发。
    3. 将使用市售的革兰氏染色试剂。
    4. 用实验室湿巾清洁显微镜幻灯片。
  2. 协议
    1. 移液 10 μL 磷酸盐缓冲盐水或培养汤在幻灯片上。
    2. 将细菌菌群涂抹到液体中,产生薄薄的均匀层。
      注意:不要使用超过 24 小时的培养物,因为年龄过老的细菌可能会改变其细胞壁,从而影响革兰氏染色结果 (1, 4)。
    3. 完全风干滑轨。
    4. 干燥后,通过火焰(细菌侧向上)滑动来修复细菌,4-5次。
      注意:请勿将幻灯片在火焰中保持太久,否则可能会扭曲细菌细胞 (1)。
    5. 在水槽上工作,握住滑动水平,应用革兰氏的水晶紫罗兰完全覆盖热固定细菌,允许站立45秒。
    6. 以一定角度握住滑轨,将温和的间接水流喷到滑道上,让它流过染色的细菌,冲洗多余的水晶紫罗兰。不要将水直接喷到细菌上。
    7. 再次保持滑动水平,应用革兰氏碘溶液完全覆盖染色细菌,允许站立45秒。
    8. 如上文步骤 1.2.6 所示,冲洗过量碘。
    9. 在以一定角度握住幻灯片时,在幻灯片上加入几滴去色剂,让它滴过染色的细菌,直到径流清除;通常,大约5秒。立即用水冲洗,如上述步骤 1.2.6 所示。
      注意:这是协议中的关键步骤。允许去色剂滴流过长或不够长将导致错误的革兰染色 (4)。
    10. 再次按住滑台,应用格拉姆的萨夫兰林完全覆盖细菌,允许站立45秒。
    11. 如上文步骤 1.2.6 所示,冲洗过量的萨夫兰宁。
    12. 擦,不要擦,多余的水从幻灯片使用纸巾。
    13. 使用具有 100X 目标的油浸式检查显微镜上的幻灯片。
  3. 结果和数据分析
    1. 革兰氏阳性细菌会染上紫色。
    2. 革兰氏阴性细菌会染红。
    3. 细菌的形状(球菌、杆菌、弯曲棒、螺旋)是可见的。
    4. 细菌细胞(单个细胞、成对细胞、细胞链、簇、分组)的排列将可见。

2. 胶囊染色

  1. 设置
    1. 戴上手套和实验室外套作为染料弄脏手和衣服。
    2. 要制备1%的水晶紫罗兰溶液,将0.25克水晶紫罗兰与25 mL蒸馏水混合,直至溶解。
    3. 要制备 1% 刚果红溶液,将 0.25 克刚果红与 25 mL 蒸馏水混合,直到溶解。
    4. 用实验室湿巾清洁幻灯片。
  2. 协议
    1. 将 10 μL 刚果红色放在幻灯片上。
    2. 使用移液头,将细菌菌群涂抹到染料中,产生薄均匀层。
    3. 完全风干滑道与染料/细胞混合物,5-7分钟。
      注意:不要加热固定,因为加热会使胶囊脱水或变形。
    4. 用1%的水晶紫罗兰涂抹1分钟。
    5. 以一定角度握住幻灯片,将温和的间接水流喷到滑道上,让它流过染色的细菌,冲洗多余的污渍。不要将水直接喷到细菌上。
    6. 以 45 度角握住幻灯片,直到完全风干。
    7. 在油浸下用100X的物镜检查显微镜上的涂片。
  3. 结果和数据分析
    1. 细菌细胞会染紫色。
    2. 幻灯片的背景将染暗。
    3. 在黑暗的背景下,胶囊将是细胞周围的清晰光环。

3. 内孔染色(舍弗-富尔顿法)

  1. 设置
    1. 戴上手套和不易燃的实验室外套,保护手和衣服免受染料和火焰的刺激。
    2. Bunsen 燃烧器用于加热修复细菌。使用火焰时要小心;绑回长发。
    3. 要制备 0.5% 马拉基特绿色溶液,将 0.125 克马拉基特绿色与 25 mL 蒸馏水混合,直到溶解。
    4. 使用市售的格拉姆萨弗兰林试剂溶液。
    5. 用实验室湿巾清洁幻灯片。
  2. 协议
    1. 移液 10 μl 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 或培养汤滑到幻灯片上。
    2. 使用无菌技术,将细菌菌群涂抹到液体中,产生薄薄的均匀层。
      注意:内孢子一般不会在幼细胞中形成,因此建议培养在18至36小时(9)之间。
    3. 完全风干滑轨。
    4. 通过火焰通过滑轨(细菌侧向上)加热修复 4-5 次。
    5. 为了帮助控制染料,将一张透镜纸(切成适合细菌涂片)放在热固定涂片上。
    6. 饱和透镜纸,带马拉奇特绿色溶液。
    7. 将幻灯片放在热板上的沸水烧杯上,蒸汽滑动 5 分钟,根据需要一次添加更多染料滴,使透镜纸保持湿润。
      注意:避免过热和干燥染料溶液。
    8. 从烧杯中取出幻灯片,取出并丢弃镜头纸,让幻灯片冷却 2 分钟。
    9. 以一定角度握住滑轨,将温和的间接水流喷到滑道上,使其在涂抹上排出,从而彻底冲洗。
    10. 保持滑动水平,洪水涂抹与萨夫兰宁,让站立1分钟。
    11. 如上文步骤 3.2.9 所示,冲洗过量的萨夫兰宁。
    12. 允许风干。
    13. 在浸入油的显微镜下检查滑动,目标为 100X。
  3. 结果和数据分析
    1. 孢子会染绿色。
    2. 植物细胞会染红。
    3. 一些植物细胞将含有孢子;细胞会染红,而内孢子会染绿色。

细菌是微生物,具有许多显著特征,如形状、细胞排列、是否产生胶囊以及是否形成孢子。这些特征都可以通过染色和帮助识别和分类不同的细菌物种来可视化。

为了检查细胞形状和排列的前两个特征,我们可以使用一种叫做革兰染色的简单技术。在这里,水晶紫罗兰被应用于细菌,这些细菌被热固定在幻灯片上。然后应用去色剂,任何含有厚肽的细菌都会染上紫色,因为脱色剂不容易穿透这一层。这些细菌被称为革兰氏阳性。

革兰氏阴性细菌具有更薄的肽类,会去污脱色剂,失去紫色。然而,当添加沙夫兰宁计数器染色时,它们会染红-粉红色,与外侧的脂多糖层结合。一旦染色,细胞可以观察到形态,大小和排列,如链或簇,这进一步有助于分类和识别。

微生物学家工具包中的另一个有用技术是胶囊染色,用于可视化环绕某些类型的细菌细胞的外部胶囊。由于胶囊的非离子成分和排斥污渍的倾向,简单的染色方法将不起作用。相反,使用负染色技术,首先用酸性着色剂(如刚果红)在细菌细胞被水晶紫罗兰染色之前,将背景染色。这留下任何胶囊作为一个明确的光环在细胞周围存在。

这里介绍的最后一个主要染色技术可以帮助确定正在研究的细菌是否形成孢子。在不利条件下,一些细菌产生内孢子,休眠,坚韧,非生殖结构,其主要功能是确保细菌通过环境压力时期,如极端温度或脱水生存。然而,并非所有的细菌物种都产生内孔,它们很难用标准技术染色,因为它们对许多染料是不可渗透的。舍弗-富尔顿方法使用麦芽绿染色,应用于固定在幻灯片上的细菌。然后用清水冲洗幻灯片,然后再用沙夫兰果进行反污。植物细胞将显示粉红色-红色,而任何存在内窥镜将呈绿色。在本视频中,您将学习如何执行这些常见的细菌染色技术,然后使用光显微镜检查染色样品。

开始手术时,系好长发,并穿上适当的个人防护装备,包括实验室外套和手套。

然后,用实验室擦拭清洁新的显微镜幻灯片。接下来,移液器 10 微升 1X 磷酸盐缓冲盐水放在第一个幻灯片上。然后,使用无菌移液器尖端从 LB 琼脂板中选择单个细菌菌落。涂抹液体中的细菌菌群,产生薄的均匀层。将幻灯片放在工作台面上,使其完全晾干。

干燥后,点燃邦森燃烧器加热固定细菌。使用钳子,通过燃烧器火焰几次滑动,细菌侧起,注意不要将幻灯片在火焰中保持太久,这可能会扭曲细胞。

现在,在水槽上工作,握住滑台,涂上几滴革兰的水晶紫罗兰,完全覆盖细菌涂抹,然后将幻灯片放在长凳上,站立 45 秒。接下来,以一定角度握住幻灯片,轻轻将水流喷到幻灯片顶部,注意不要直接喷出细菌污迹。现在,再次保持滑动水平,应用Gram的碘溶液,以完全覆盖染色的细菌,然后,让它再站立45秒。接下来,仔细冲洗幻灯片中的碘,如前所述。在以一定角度握住幻灯片时,向幻灯片添加几滴 Gram 的脱色剂,使其在染色细菌上运行,直到决选清除,大约 5 秒。立即用水冲洗,如前所述。这将限制涂片过度脱色。接下来,再次按住幻灯片水平,应用革兰氏的沙夫兰宁反污,以完全覆盖染色的细菌。45 秒后,用水轻轻冲洗幻灯片中的沙夫兰,如前所述,然后用纸巾擦干。

最后,将一滴浸入油直接添加到幻灯片中,然后用带 100X 油镜镜的光学显微镜检查幻灯片。

要开始这种染色协议,首先穿上正确的个人防护设备,然后确保将使用的玻璃玻片清洁。

接下来,准备解决方案。要制作 1% 的水晶紫色溶液,将 0.25 克的水晶紫色粉末与 25 毫升蒸馏水混合,然后涡旋直至溶解。然后,通过将 0.25 克刚果红粉与 25 毫升蒸馏水和涡旋混合,直到溶解,制备 1% 刚果红色溶液。现在,移液器10微升的刚果红色溶液就滑上了。使用清洁无菌移液器尖端,从 LB 琼脂板中选择单个细菌菌落。然后,将细菌菌群涂抹到染料中,产生薄的、均匀的层。完全空气干燥细菌滑轨 5-7 分钟。一旦幻灯片干燥,用足够的1%的水晶紫罗兰覆盖涂片,让它坐1分钟。现在,以一定角度握住幻灯片,轻轻地将水流喷到幻灯片顶部,注意不要直接喷出细菌。继续以 45 度角握住滑轨,直到完全风干。最后,将一滴浸入油直接添加到幻灯片中,然后使用具有 100X 油镜的光学显微镜检查幻灯片。

要执行内孔染色,首先,通过混合 0 制备 0.5% 的麦芽绿溶液。125克马拉奇特绿色粉末与25毫升蒸馏水,然后涡旋溶液,直到溶解。接下来,将移液器 10 微升的 1X PBS 放在幻灯片的中心。然后,使用无菌移液器尖端从 LB 琼脂板中选择单个细菌菌落。将细菌涂抹到液体中,产生薄薄的均匀层。现在,将幻灯片放在工作台面上,使其完全晾干。干燥后,点燃邦森燃烧器加热固定细菌。通过蓝色燃烧器火焰几次的幻灯片,细菌侧朝上。然后,一旦幻灯片冷却,将一张预切透镜纸放在热固定涂片上。接下来,打开一个热板到最高设置,并带来水烧杯沸腾。

用麦芽绿溶液使透镜纸饱和,并使用钳子将幻灯片放在沸水烧杯顶部,蒸汽5分钟。根据需要添加更多染料,每次一滴,以保持透镜纸的湿润。接下来,再次使用钳子,从烧杯中取出幻灯片,取出并丢弃镜头纸。让幻灯片冷却 2 分钟。在水槽上工作,以一定角度握住幻灯片,然后轻轻地将水流喷到滑道顶部。现在,按住幻灯片水平并应用沙夫兰来完全覆盖幻灯片。然后,让它站立1分钟。接下来,以一定角度握住幻灯片,并冲洗,如前所述。让滑轨在工作台面上晾干。最后,将一滴浸入油直接添加到幻灯片中,然后用光学显微镜检查幻灯片,使用 100X 油镜。

在革兰染色协议中,可能会导致两种不同的颜色污渍。深紫色染色表明细菌是革兰氏阳性,并且它们保留了水晶紫罗兰色。相比之下,红粉染色是革兰氏阴性细菌的特征,相反,这种细菌将被沙夫兰蛋白计数器染色着色。此外,在革兰氏染色后,可以可视化细菌的不同形状和排列。例如,与通常聚集成团或单独发生的细菌相比,可以区分球菌或圆形细菌和棒状杆菌,或识别形成链的细菌。

在胶囊染色显微镜图像中,细菌细胞通常会被染成紫色,并且幻灯片的背景应暗色。在这种黑暗背景下,细菌的胶囊,如果存在,将表现为细胞周围的透明光晕。

最后,在内皮染色中,植物细胞将被沙夫兰林计数器染色染成红色。如果样品中存在内孢子,这些孢子将保留麦芽绿染色,并呈现出蓝绿色。

Applications and Summary

细菌具有明显的特性,有助于识别细菌。其中一些特征可以通过染色和光显微镜来观察。三种可用于观察这些特征的染色技术是革兰染色、胶囊染色和内孔染色。每种技术都可识别细菌的不同特性,并可用于帮助医生为患者推荐治疗方案、识别样品或食品中的潜在污染物以及验证样品无菌性。

References

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显微镜和染色:革兰克、胶囊和内孔染色
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