Summary
Aquí se describe una nueva técnica de proteómica cuantitativa para la identificación de complejos de proteínas en Saccharomyces cerevisiae. En este estudio, hemos utilizado el método de SILAC junto con la purificación de afinidad seguida de espectrometría de masas para identificar con una alta especificidad de la unión de compañeros de una proteína del RE, Scs2p.
Abstract
Los lípidos son los componentes de las membranas celulares que funcionan como barreras y en la compartimentación de los procesos celulares, y recientemente, como importantes moléculas de señalización intracelular. Sin embargo, a diferencia de las proteínas, los lípidos son pequeñas moléculas hidrofóbicas que el tráfico sobre todo por el mal descrito rutas nonvesicular, que son la hipótesis de que se produzca en los sitios de contacto con la membrana (MCS). MCS son las regiones donde el retículo endoplasmático (ER) se pone en contacto físico directo con una asociación orgánulos, por ejemplo, la membrana plasmática (PM). La porción de ER ER-PM MCS se enriquece en la síntesis de lípidos, enzimas, lo que sugiere que la síntesis de lípidos se dirige a estos sitios y lo que implica que los SCM son importantes para el tráfico de lípidos. La levadura es un modelo ideal para estudiar ER-PM MCS debido a su abundancia, con más de 1.000 contactos por celular, y su naturaleza se conserva en todos los eucariotas. Descubrimiento de las proteínas que constituyen la MCS es fundamental para la comprensión de cómo el tráfico de lípidos se lleva a cabo en las células, y la forma en que actúan como moléculas de señalización. Hemos encontrado que una llamada ER Scs2p localizar a ER-PM MCS y es importante para su formación. Nos hemos centrado en el descubrimiento de los socios de Scs2p molecular. Identificación de los complejos de proteínas tradicionalmente se basa en la primera resolución de muestras purificadas de proteínas por electroforesis en gel, seguido por la digestión en gel de bandas de proteínas y el análisis de los péptidos mediante espectrometría de masas. A menudo, esto limita el estudio a un pequeño subconjunto de proteínas. Además, los complejos de proteínas están expuestos a la desnaturalización o condiciones no fisiológicas durante el procedimiento. Para evitar estos problemas, hemos puesto en marcha una técnica de gran escala proteómica cuantitativa para extraer datos imparciales y cuantificados. Usamos el etiquetado de isótopos estables con aminoácidos en cultivo celular (SILAC) para incorporar los núcleos de isótopos de primera necesidad en las proteínas de una cepa control sin etiquetar. Volúmenes iguales de la cultura de etiqueta y sin etiqueta, cultura SILAC marcado se mezclan y se lisaron por molienda en nitrógeno líquido. A continuación, llevar a cabo un procedimiento de purificación de la afinidad para tirar hacia abajo los complejos de proteínas. Por último, se precipitan las proteínas de la muestra, que está listo para su análisis por cromatografía líquida de alta resolución / espectrometría de masas en tándem. Más importante aún, las proteínas de la cepa de control están marcados por el isótopo pesado y producirá un cambio de masa / carga que se puede cuantificar en contra de las proteínas sin marcar en la cepa de cebo. Por lo tanto, los contaminantes, o la unión no específica se pueden eliminar fácilmente. Con este enfoque, se han identificado varias proteínas nuevas que se localizan en el ER-PM MCS. Aquí se presenta una descripción detallada de nuestro enfoque.
Protocol
Materiales y Métodos
- Cepas de levadura
- Todas las cepas utilizadas en este estudio se basan en el fondo BY4742. La cepa de control SILAC (Mat uno, his3, leu2, ura3, LYS2 y arg4:: G418) se hizo en el apareamiento arg4 supresión cepa (Mat uno, HIS3, URA3, leu2 y arg4:: G418) a BY4742 (Mat alfa, his3, leu2, ura3 y LYS2), y los haploides meiótica se obtuvieron por disección tétrada. Por lo tanto, la tensión de control es una auxótrofo de lisina y arginina. La cepa de cebo se hizo por PCR mediada por recombinación homóloga con el vector pBS1479. Por lo tanto, la etiqueta epítopo utilizado en este estudio es la purificación por afinidad en tándem (TAP) etiqueta (3).
- SILAC:
- La cepa de control SILAC se cultivó en los medios de comunicación de abandono mínimo suplementado con L-lisina-4 del 98% ,4,5,5-D4 (0,03 g / L, Cambridge isótopos) y el 98% de L-arginina-13 C 6 (0,036 g / L, Cambridge isótopos).
- La cepa de cebo fue cultivada en medio rico regular con normalidad aminoácidos isotópica.
- Primera etapa de purificación TAP [Este protocolo es una adaptación del Cold Spring Harbor supuesto manual de laboratorio (4)]
** La noche anterior, su purificación pre-chill mortero de -80 ° C congelador. Asimismo, antes de relajarse en un vaso de -20 ° C **
Hacer que estos buffers momento de su utilización (por 1 L de la cultura):- 30 ml de NP-40 tampón con 25 l PIC (1 / 2000), 50 l de DTT 1M
- 20 ml de NP-40 con buffer de 1 / 200 del CFP, 50 l de DTT 1M
- 10 ml de TEV-C con buffer 1 / 2000 CFP, 10 l de 1 M de TDT
SILAC y preparación
- Crecer cada 1L de la cepa de cebo y el control de la cepa por separado a OD 600 = 1.0 a 1.3.
- Vierta la cultura en tubos de centrífuga de 500 ml Nalgene. Equilibrar la carga y las células de pellets en 2580X g.
- Decantar los medios de comunicación y el pellet se resuspende con 50 ml de frío O DH 2 durante la transferencia de las células a tubos de centrífuga de 50 ml. Pellet células. ** Se puede congelar el sedimento a -80 ° C **
- ** IMPORTANTE ** coincidir con el cultivo de la cepa de control para el cultivo de la cepa de cebo en 1:1 por peso seco de pellets.
- Resuspender cada pellet de células en 10 ml de NP-40 con buffer Cocktail 1 / / 2000 inhibidor de la proteasa (PIC).
- Mezclar los dos cultivos celulares por decantación directamente un tubo al otro.
Molienda - Vierta el líquido N 2 en el mortero pre-enfriado y deje que se evapore completamente. Añadir 2 ml de células para el mortero con un movimiento circular. Vierta un poco de N 2 líquido para congelar las células. Triturar las células hasta que las células se vuelven polvo fino. Repita el proceso hasta que todas las células son de tierra. ** No permita que las células que se descongele. Agregue el líquido N 2 cuando sea necesario **
- Transferir el polvo a un vaso de helado y descongelar a temperatura ambiente. Cuando los bordes comienzan a derretirse, agregar 20 ml de NP-40 con buffer de 1 / 200 del CFP.
- Transferencia de lisado crudo a 40 ml tubos de Nalgene. Giran a 39.000 xgfor 30 min.
- Mientras espera, tomar 300 l de Sepharosa cuentas 2B (GE). Lavado de los granos en 300 l de buffer de NP-40 (1 / 2, 000 PIC) 3 veces. Volver a suspender las bolas en 300 l de amortiguación a fin de que se encuentran en suspensión 1:1.
Pre-limpieza de células lisado - Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y añadir las cuentas 2B Sepharose. Incubar en una plataforma giratoria en el cuarto frío durante 30 minutos.
- Mientras espera, tomar 300 l de IgG Sepharose 6 cuentas (GE). Lavado de los granos en 300 l de buffer de NP-40 (1 / 2, 000 PIC) 3 veces. Volver a suspender las bolas en 300 _l buffer de modo que se encuentren en suspensión 1:1.
- Pellet de las cuentas. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. ** Guardar una alícuota del lisado celular de Western Blot tarde **
La unión a IgG Sepharose bolas - Quitar las cuentas 2B Sepharose por centrifugación. Agregar las cuentas de IgG (previamente preparadas en lechada 01:01). Separar el contenido en dos tubos para la unión sea más eficiente. Incubar en una plataforma giratoria en la cámara fría durante 2 horas.
- De girar las bolas. ** Guardar una alícuota de la fracción no unida **
- Lávese las cuentas con 10 ml de NP-40 buffer (1 / 2, 000 PIC).
- Lávese las cuentas con 3 ml de TEV-C de amortiguación (1 / 2, 000 PIC). ** Guardar una alícuota de las cuentas. Esto refleja la eficiencia de unión **
Liberadores de cuentas de IgG por escisión de la proteasa TEV - Añadir 5 l de AcTEV a 1 ml de TEV-C buffer (con 1 / 2, 000 PIC). Después de mezclar, separar los contenidos en dos tubos Eppendorf de 1,5 ml de la mezcla más eficiente. Incubar en una plataforma giratoria en el cuarto frío durante la noche.
- De girar las cuentas y transferir el eluato a un nuevo tubo de 1.5 ml. Lave las cuentas con otro 0,5 ml de TEV-C buffer
- Combine la elaute en un tubo. Usted debe tener 1,5 ml de eluido en total.** Guardar una alícuota del eluido TEV **
El ácido tricloroacético (TCA) precipatation (Para el análisis de espectrometría de masas basado, recomendamos el uso de EtOH / precipitación de acetato) - Ajustar alícuotas de 25% TCA TCA con un 100%. Para ello, aparte que el efluente de 1,5 ml en dos tubos de 750 l cada uno. Añadir 250 ml del 100% de TCA en el tubo. Su solución debe a su vez de leche.
- Coloque sobre hielo durante 30 minutos con agitación periódica.
- Girar a la velocidad máxima en la centrífuga de mesa en el cuarto frío durante 30 minutos.
- Lavar una vez con 500 l de helado de acetona que contiene 0,05 N HCl y girar durante 5 minutos a máxima velocidad (sala fría).
- Lavar una vez con 500 l de helado de acetona y vuelta por 5 min a max (sala fría).
- Retire con cuidado la acetona y seco en pelets.
- Para la tinción de plata, resuspender el precipitado en 50 l de tampón 1X muestra de SDS.
EtOH / acetato de precipatation - Agregar 20 g de glucógeno
- Diluir las muestras 5 veces con EtOH al 100% y ajuste a 50 mM NACH 3 COO con un stock de 2,5 M, pH 5,0
- Soporte para la solución de 2h
- Pellet precipitó la proteína por centrifugación durante 10 minutos a 12.000 x g, a temperatura ambiente.
NP-40 Buffer (por 200 ml)
| Concentración de la | Añadir | |
| Sódico 10 mM de tampón fosfato (pH 7,2) | 0,1 M | 20 ml |
| 150 mM NaCl | 2 M | 15 ml |
| 1% NP-40 | 100% | 2 ml |
| 50 mM NaF | 1 M | 10 ml |
| 0,1 mM Na 3 VO 4 | 10 mM | 2 ml |
| Volumen a 200 ml | ||
AÑADIR antes de su uso:
- 1 / 1, 000 de 1 M de TDT
- 1 / 2, 000 del CFP (Inhibidores de la proteasa Cocktail)
TEV-C Buffer (por 50 ml)
| Concentración de la | Añadir | |
| 25 mM Tris (pH 8,0) | 100 mM | 12,5 ml |
| 150 mM NaCl | 2 M | 3,75 ml |
| 0,1% NP-40 | 100% | 50 _l |
| 0,5 mM EDTA | 500 mM | 50 __l |
| Volumen de 50 ml | ||
AÑADIR antes de su uso:
- 1 / 1, 000 de 1 M de TDT
- 1 / 2, 000 de los PIC
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Discussion
Las alícuotas guardado durante el procedimiento de purificación que incluyen (1) pre-aprobados lisado celular, (2) fracción unida, (3) fracción libre, y (4) fracción eluida. Le recomendamos analizar el contenido de proteínas de las alícuotas anteriormente por Western Blot utilizando anticuerpos anti-TAP o tinción de plata para reflejar la eficacia vinculante y liberadores del experimento. Ejemplos de un gel de plata de colores y una mancha se muestra en la Figura 1.
Desde SILAC nos proporciona mediciones imparcial y cuantificados de socios de la unión a proteínas, que sólo la primera etapa de la purificación TAP para minimizar la pérdida de la muestra. Si usted experimenta una cantidad significativa de uniones inespecíficas, es posible que desee llevar a cabo todo el protocolo, que se puede encontrar en el manual de frío del puerto del resorte (4).
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References
- Loewen, C. J. Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization. Jour. Cell Biol. 179, 467-483 Forthcoming.
- Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics. Methods. 29, 124-130 Forthcoming.
- Puig, O. The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 Forthcoming.
- Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 123-125 Forthcoming.
