鉴定与定量蛋白质组学在酿酒酵母中的蛋白质复合物

Summary

在这里，我们描述了一个新的量化确定在酿酒酵母中的蛋白质复合物的蛋白质组学技术。在这项研究中，我们一起串联质谱法，具有高特异性识别ER蛋白，Scs2p的具有约束力的合作伙伴的亲和纯化使用的SILAC方法。

Abstract

血脂，细胞膜功能的细胞过程中条块分割的壁垒和积木，最近，作为重要的细胞内信号分子。然而，与蛋白质，脂类是小的疏水性分子的交通主要是由不良描述nonvesicular路线，这是假设发生在膜接触点（MCSS）。热对流是内质网（ER）与一个合作伙伴的细胞器，如细胞膜（下午）直接的身体接触的地区。丰富脂质合成酶的ER - PM的热对流的ER部分，这表明，脂质合成是针对这些网站和暗示的MCS是重要的脂质交通。酵母是一种理想的模型来研究ER - PM的，因为它的丰富的MCS与超过1000个联系人，每个细胞中，和他们在所有真核生物中保守性，。发现的蛋白质构成的MCS是至关重要的理解血脂交通是如何在细胞内完成，以及它们如何作为信号分子的行为。我们发现，所谓的Scs2p一个ER本地化ER - PM的MCS，其形成的重要。我们专注于揭露Scs2p分子伙伴。鉴定蛋白质复合物的传统依赖于首​​先解决凝胶电泳凝胶的蛋白条带的消化和分析肽质谱，纯化的蛋白质样品。这往往限制了研究的蛋白质的一小部分。此外，蛋白质复合物的暴露变性或在手术过程中的非生理条件。为了规避这些问题，我们已实施了大规模的定量蛋白质组学技术提取公正和量化的数据。我们用稳定同位素标记氨基酸在细胞培养（SILAC）纳入蛋白质在无标记的控制应变主食同位素原子核。标签的文化和无标记的，SILAC标记的文化等量混合在一起，并在液氮研磨溶解。然后，我们开展的亲和纯化过程拉下蛋白质复合物。最后，我们沉淀的蛋白质样品，这是准备通过高性能的液相色谱/串联质谱分析。最重要的是，在控制菌株的蛋白质是由重同位素标记会产生一个质量/充电的转变，可对未标注蛋白质量化诱饵应变。因此，污染物，或者非特异性结合，可以很容易地消除。通过使用这种方法，我们已经确定了一些新的蛋白质，定位于ER - PM的MCS。在这里，我们提出了我们的方法的详细描述。

Protocol

材料和方法

1. 酵母菌株
   • 在这项研究中使用的所有菌株的基础上BY4742背景。 SILAC控制应变（ 垫的，HIS3，LEU2，URA3，lys2和arg4：G418）是由交配arg4缺失株（ 垫，HIS3，URA3，LEU2，和arg4：G418）BY4742（垫阿尔法， HIS3，LEU2，URA3和lys2），减数分裂单倍体获得四分体夹层。因此，控制应变是赖氨酸和精氨酸营养缺陷型。使用矢量pBS1479 PCR介导的同源重组诱饵应变。因此，在这项研究中所使用的抗原表位标记的串联亲和纯化（TAP），标签（3）。
2. SILAC：
   • SILAC控制株生长在最小辍学培养基，98％的L -赖氨酸- 4 ,4,5,5 - D4（0.03 g / L的，剑桥同位素）和98％L -精氨酸^- ₁₃ C 6（0.036克/ L时，剑桥同位素）。
   • 诱饵应变定期丰富的培养基中生长正常的同位素氨基酸。
3. 第一阶段的TAP纯化[此协议是改编自冷泉港实验室课程手册（4）]
   
   **您的净化，预寒意迫击炮和杵在-80 ° C冰箱前的夜晚。此外，前寒意一个烧杯-20 ° C **
   
   之前做出正确的使用这些缓冲区（1升文化）：
   • 30毫升的NP - 40缓冲液25μLPIC（1 / 2000），50μL1M数码地面电视
   • 20毫升的NP - 40与1 / 200 PIC，50μL1M数码地面电视的缓冲区
   • 10毫升的TEV - C的缓冲与PIC的1 / 2000，10μL的1 M数码地面电视

SILAC和准备

1. 长1L诱饵的应变和控制每一株分别外径₆₀₀ = 1.0-1.3。
2. 倒入500ml中NALGENE离心管文化。 2580X G.平衡负载和颗粒细胞
3. 倒出媒体和重新悬浮颗粒冷DH _{2 O50}毫升细胞转移至50ml离心管。沉淀细胞。 **您可以冻结颗粒在-80 ° C **
4. **重要**匹配控制在1:1的诱饵菌种菌种干颗粒重量。
5. 重悬NP - 40与1 / / 2,000蛋白酶抑制剂（PIC），缓冲区的每个细胞沉淀于10ml。
6. 混合两个细胞培养，直接到其他调迁一管。
   
   研磨
   
   
7. 倒入液态_氮预冷迫击炮，并允许它完全蒸发。加入2毫升细胞砂浆打圈。倒入一些液体_氮冻结的细胞。研磨细胞，待细胞成为细粉。重复这一过程，直到所有的细胞是地面。 **不要让解冻的细胞。添加液态_氮必要时**
8. 粉转移到冰冷的烧杯中，在室温下解冻。当边缘开始解冻，1 / 200的PIC添加20毫升NP - 40的缓冲区。
9. 转移原油裂解液40毫升NALGENE管。旋转39000 xgfor 30分钟。
10. 在等待过程中，采取300μL琼脂糖凝胶2B珠公司（GE）。 NP - 40缓冲液（1 / 2，000 PIC），3次在300μL清洗珠。在300μL缓冲液重悬珠，使他们在1:1水泥浆。
    
    预结算细胞裂解液
    
    
11. 将上清转移至新管，并添加琼脂糖凝胶2B珠。在30分钟的冷室的旋转平台上孵育。
12. 在等待过程中，取300μL的IgG琼脂糖凝胶6珠公司（GE）。 NP - 40缓冲液（1 / 2，000 PIC），3次在300μL清洗珠。重悬在300 _L缓冲区珠，使他们在1:1水泥浆。
13. 颗粒的珠子。将上清转移至新管。 **保存Western杂交后的细胞裂解液分装**
    
    绑定到IgG抗体琼脂糖珠
    
    
14. 取出离心琼脂糖凝胶2B珠。新增的IgG珠（以前1:1浆准备）。为更有效地结合管分为两个独立的内容。在寒冷的房间为2小时的旋转平台上孵育。
15. 自旋向下的珠子。 **保存的绑定派等分**
16. 用10毫升NP - 40缓冲液（1 / 2，000 PIC），珠。
17. 洗3毫升TEV - C的缓冲液（1 / 2，000 PIC），珠。 **保存珠等分。这将反映效率约束力**
    
    TEV蛋白酶裂解IgG抗体珠洗脱
    
    
18. 添加5μLAcTEV1毫升TEV - C的缓冲液（1 / 2，000 PIC的）。混合后，分成两个1.5毫升Eppendorf管的内容，更高效混合。在寒冷的房间旋转平台上，孵育过夜。
19. 旋珠和洗脱液转移到一个新的1.5 ml管。 TEV - C的缓冲液0.5毫升清洗珠
20. 结合一管elaute。你应该有共1.5毫升洗脱液。**保存等分的TEV洗脱液**
    
    三氯乙酸（TCA）precipatation（质谱为基础的分析，我们建议使用乙醇/醋酸沉淀）
    
    
21. 调整分装至25％，100％TCA TCA。要做到这一点，分成2管各750μL1.5 ml洗脱液。加入250μL100％的TCA管。您的解决方案应该变成乳白色。
22. 置于冰上30分钟周期性振荡。
23. 在30分钟的冷房中的表离心机以最大的速度旋转。
24. 用500μL冰冷的最高速度（冷室）5分钟的0.05 ñ盐酸和自旋丙酮洗一次。
25. 冰冷的丙酮和最大（冷室）5分钟的旋转与500μL洗一次。
26. 小心取出丙酮和干燥颗粒。
27. 银染法，在50μL1X SDS样品缓冲液重悬沉淀。
    
    乙醇/醋酸precipatation
    
    
28. 加入20微克的糖原
29. 5X 100％乙醇稀释样品，并调整与250万的股票，pH值5.0至50毫米_NaCH 3 COO
30. 2小时的待机解决方案
31. 颗粒沉淀，离心10 min，室温在12000 X克蛋白质。

NP - 40缓冲液（200毫升）

	股权集中度	添加
10 mM磷酸钠缓冲液（pH值7.2）	0.1 M的	20毫升
150 mM氯化钠	2米	15毫升
1％NP - 40	100％	2毫升
50 mM的氟化钠	1米	10毫升
0.1毫米的Na 3 VO 4	10毫米	2毫升
容至200 ml

在使用前添加：

1. 1 / 1，000 1米的数码地面电视
2. 1 / 2，000 PIC（蛋白酶抑制剂的鸡尾酒）

TEV - C的缓冲液（50毫升）

	股权集中度	添加
25毫米的Tris（pH值8.0）	100毫米	12.5毫升
150 mM氯化钠	2米	3.75毫升
0.1％NP - 40	100％	50 _L
0.5毫米EDTA	500毫米	50 __l
容至50 ml

在使用前添加：

1. 1 / 1，000 1M数码地面电视
2. 1 / 2，000的PIC

Discussion

在纯化过程中保存的等分应包括：（1）事先批准的细胞裂解液，（2）约束的一小部分，（3）不作承诺的一小部分，以及（4）洗脱组分。我们建议由西方上述等份分析的蛋白质含量，杂交使用抗TAP抗体或银染色，以反映实验的约束力和洗脱效率。一个银染凝胶和印迹的例子，如图1所示。

由于SILAC我们提供公正和量化的测量与蛋白结合的合作伙伴，我们只能做的TAP纯化的第一阶段，以尽量减少样品的损失。如果遇到大量的非特异性结合，您可能希望进行的整个协议，可以在冷泉港手册（4）发现。