Summary
Qui si descrive una nuova tecnica di proteomica quantitativa per identificare i complessi proteici in Saccharomyces cerevisiae. In questo studio, abbiamo utilizzato il metodo SILAC insieme purificazione di affinità seguita dalla spettrometria di massa tandem per identificare con elevata specificità dei partner legame di una proteina ER, Scs2p.
Abstract
I lipidi sono i componenti delle membrane cellulari che funzionano come barriere e nella compartimentazione dei processi cellulari, e di recente, come importanti molecole di segnalazione intracellulare. Tuttavia, a differenza delle proteine, i lipidi sono piccole molecole idrofobiche che il traffico principalmente da poco descritto percorsi nonvesicular, che si ipotizza che si verifichino presso i siti di contatto a membrana (MCS). MCS sono regioni in cui il reticolo endoplasmatico (ER) rende il contatto fisico diretto con una partnership organello, ad esempio, membrana plasmatica (PM). La porzione di ER ER-PM MCS è arricchita in lipidi sintetizzare gli enzimi, il che suggerisce che la sintesi dei lipidi si rivolge a questi siti e implicando che MCS sono importanti per il traffico dei lipidi. Il lievito è un modello ideale per studiare ER-PM MCS a causa della loro abbondanza, con oltre 1000 contatti per cella, e la loro natura conservata in tutti gli eucarioti. Scoprire le proteine che costituiscono MCS è fondamentale per capire come si realizza il traffico lipidi nelle cellule, e come si comportano come molecole di segnalazione. Abbiamo trovato che un pronto soccorso chiamato Scs2p localizzare a ER-PM MCS ed è importante per la loro formazione. Il nostro obiettivo è scoprire i partner molecolari di Scs2p. L'identificazione di complessi proteici si basa tradizionalmente sulla prima risolvere campioni di proteine purificate mediante elettroforesi su gel, seguita da in-gel digestione delle bande proteiche e analisi dei peptidi mediante spettrometria di massa. Questo limita spesso lo studio di un piccolo sottoinsieme di proteine. Inoltre, complessi proteici sono esposti a denaturazione o non le condizioni fisiologiche durante la procedura. Per aggirare questi problemi, abbiamo realizzato un grande tecnica proteomica quantitativa per estrarre i dati imparziale e quantificati. Noi usiamo l'etichettatura degli isotopi stabili di aminoacidi nelle cellule in coltura (SILAC) per incorporare i nuclei di base di isotopi di proteine in un ceppo di controllo senza tag. Volumi uguali di cultura tag e senza tag, la cultura SILAC marcati sono mescolati insieme e lisate dalla macinazione in azoto liquido. Abbiamo poi effettuare una procedura di purificazione di affinità di abbattere complessi proteici. Infine, precipitare il campione, che è pronto per l'analisi ad alte prestazioni cromatografia liquida / spettrometria di massa tandem. Ma soprattutto, proteine del ceppo di controllo sono etichettati dai isotopo pesante e produrranno una massa / carica spostamento che può essere quantificata contro le proteine senza etichetta nel ceppo esca. Pertanto, contaminanti, o legame aspecifici possono essere facilmente eliminati. Utilizzando questo approccio, abbiamo individuato diverse nuove proteine che localizzano a ER-PM MCS. Presentiamo qui una descrizione dettagliata del nostro approccio.
Protocol
Materiali e Metodi
- Ceppi di lievito
- Tutti i ceppi utilizzati in questo studio si basano sullo sfondo BY4742. Ceppo di controllo SILAC (Mat uno, his3, leu2, ura3, lys2 e Arg4:: G418) è stata fatta con l'accoppiamento Arg4 ceppo cancellazione (Mat uno, his3, ura3, leu2 e Arg4:: G418) per BY4742 (Mat alfa, his3, leu2, ura3 e lys2), e la haploids meiotico sono stati ottenuti mediante dissezione tetrade. Pertanto, il ceppo di controllo è un auxotroph di lisina e arginina. Il ceppo esca è stata fatta da PCR-mediata ricombinazione omologa con il vettore pBS1479. Pertanto, il tag epitopo utilizzato in questo studio è la purificazione di affinità tandem (TAP) tag (3).
- SILAC:
- Il ceppo di controllo SILAC è stato coltivato in mezzi di abbandono minimale integrato con il 98% di L-lisina-4 ,4,5,5-D4 (0,03 g / L, Cambridge Isotope) e il 98% di L-arginina-13 C 6 (0,036 g / L, Cambridge Isotope).
- Il ceppo è stato coltivato in esca regolarmente medio ricco di acidi normale isotopica aminoacidi.
- Prima tappa di purificazione TAP [Questo protocollo è stato adattato dal Cold Spring Harbor corso manuale di laboratorio (4)]
** La notte prima della purificazione, pre-chill mortaio e pestello in freezer -80 ° C. Inoltre, pre-chill un bicchiere a -20 ° C **
Rendono questi buffer a destra prima di utilizzare (per 1 L di cultura):- 30 ml di buffer NP-40 con 25 microlitri PIC (1 / 2000), 50 ml di 1M DTT
- 20 ml di NP-40 buffer con 1 / 200 PIC, 50 ml di 1M DTT
- 10 ml di TEV-C buffer con 1 / 2000 PIC, 10 ml di 1 M DTT
SILAC e la preparazione
- Grow 1L ogni ceppo esca e il controllo ceppo separatamente per OD 600 = 1,0-1,3.
- Versare la cultura in 500 ml provette Nalgene. Bilanciare il carico e le celle a pellet 2580X g.
- Decantare i media e risospendere pellet con 50 ml di freddo dH 2 O durante il trasferimento alle cellule di provette da 50 ml. Pellet di cellule. ** È possibile congelare il pellet a -80 ° C **
- ** Importante ** corrispondere alla cultura ceppo di controllo alla cultura esca ceppo in 1:1 da peso a secco a pellet.
- Risospendere ogni pellet di cellule in 10 ml di NP-40 buffer con Cocktail proteasi 1 / / 2000 Inhibitor (PIC).
- Mescolare le due colture cellulari direttamente decantazione un tubo all'altro.
Macinazione - Versare il liquido N 2 nel pre-raffreddata malta e lasciarlo evaporare completamente. Aggiungere 2 ml di cellule al mortaio in movimento circolare. Versare qualche liquido N 2 per congelare le cellule. Macinare le cellule fino a quando le cellule diventano polvere fine. Ripetere il processo fino a quando tutte le cellule sono a terra. ** Non permettere alle cellule di disgelo. Aggiungi N 2 liquido quando necessario **
- Trasferire la polvere ad un bicchiere ghiacciato e scongelare a temperatura ambiente. Quando i bordi iniziano a sciogliersi, aggiungere 20 ml di NP-40 buffer con 1 / 200 PIC.
- Trasferimento lisato greggio a 40 ml, tubi Nalgene. Girano a 39000 xgfor 30 min.
- In attesa, prendere 300 ml di Sepharose perline 2B (GE). Lavare le perline in 300 ml di NP-40 tampone (1 / 2, 000 PIC) 3 volte. Risospendere le sfere in 300 microlitri di buffer in modo che siano in liquame 1:1.
Pre-clearing lisato cellulare - Trasferire il surnatante in una nuova provetta e aggiungere le perline 2B Sepharose. Incubare su una piattaforma rotante in camera fredda per 30 minuti.
- In attesa, prendere 300 ml di IgG Sepharose 6 perline (GE). Lavare le perline in 300 ml di NP-40 tampone (1 / 2, 000 PIC) 3 volte. Risospendere le sfere in 300 _l tampone in modo che siano in liquame 1:1.
- Pellet le perline. Trasferire il surnatante in una nuova provetta. ** Salva un'aliquota del lisato cellulare di Western Blotting in seguito **
Legame con IgG perline sefarosio - Rimuovere le perle 2B Sepharose da centrifuga. Aggiungere le perline IgG (precedentemente preparato in 1:1 liquami). Separare il contenuto in due tubi per il legame più efficiente. Incubare su una piattaforma rotante in camera fredda per 2 ore.
- Spin giù le perline. ** Salva una aliquota della fazione non legato **
- Lavare le perline con 10 ml di NP-40 tampone (1 / 2, 000 PIC).
- Lavare perline con 3 ml di buffer TEV-C (1 / 2, 000 PIC). ** Salva una aliquota delle perline. Questo riflette l'efficienza della ** vincolante
Eluizione di perle IgG per scissione della proteasi TEV - Aggiungere 5 ml di AcTEV a 1 ml di TEV-C buffer (con 1 / 2, 000 PIC). Dopo la miscelazione, separare il contenuto in due provette Eppendorf da 1,5 ml per più efficiente miscelazione. Incubare su una piattaforma rotante in camera fredda durante la notte.
- Spin giù le perline e trasferire l'eluato in una nuova 1,5 ml di tubo. Lavare le perline con l'aggiunta di 0,5 ml di TEV-C tampone
- Combinare i elaute in una provetta. Si dovrebbe avere 1,5 ml di eluato in totale.** Salva un'aliquota del eluato TEV **
Acido tricloroacetico (TCA) precipatation (Per l'analisi spettrometria di massa a base, si consiglia di utilizzare EtOH / precipitazione acetato) - Regolare aliquote al 25% TCA con il 100% TCA. Per fare questo, separato da 1,5 ml di eluato in 2 tubi da 750 microlitri ciascuno. Aggiungere 250 ml di 100% TCA al tubo. La vostra soluzione dovrebbe diventare lattiginoso.
- Mettere in ghiaccio per 30 minuti con vortex periodica.
- Girare alla massima velocità nel tavolo centrifuga in camera fredda per 30 minuti.
- Lavare una volta con 500 ml di ghiacciata acetone contenente lo 0,05 N HCl e girare per 5 minuti alla massima velocità (camera fredda).
- Lavare una volta con 500 ml di acetone ghiacciata e girare per 5 min a max (camera fredda).
- Rimuovere con cautela acetone e asciugare pellet.
- Per la colorazione argento, risospendere il pellet in 50 ml di tampone 1X campione SDS.
EtOH precipatation / acetato - Aggiungere 20 mg di glicogeno
- Diluire i campioni 5X con il 100% EtOH e regolare a 50 mm dopo le 3 COO con uno stock di 2,5 M, pH 5,0
- Stare la soluzione per 2 ore
- Pellet precipitato proteina mediante centrifugazione per 10 min a 12.000 g X a temperatura ambiente.
NP-40 Buffer (per 200 ml)
| Magazzino concentrazione | Aggiungere | |
| 10 mM tampone fosfato di sodio (pH 7,2) | 0,1 M | 20 ml |
| 150 mM NaCl | 2 M | 15 ml |
| 1% NP-40 | 100% | 2 ml |
| 50 mM NaF | 1 M | 10 ml |
| 0.1 mM Na 3 VO 4 | 10 mM | 2 ml |
| Volume a 200 ml | ||
ADD prima dell'uso:
- 1 / 1, 000 di 1 M DTT
- 1 / 2, 000 di PIC (Inibitori della proteasi Cocktail)
TEV-Buffer C (per 50 ml)
| Magazzino concentrazione | Aggiungere | |
| 25 mM Tris (pH 8,0) | 100 mM | 12,5 ml |
| 150 mM NaCl | 2 M | 3,75 ml |
| 0,1% NP-40 | 100% | 50 _l |
| 0.5 mM EDTA | 500 mM | 50 __l |
| Volume di 50 ml | ||
ADD prima dell'uso:
- 1 / 1, 000 di 1M DTT
- 1 / 2, 000 del PIC
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Discussion
Le aliquote salvati durante la procedura di purificazione dovrebbe includere (1) pre-cancellati lisato cellulare, (2) frazione legata, (3) frazione libera, e (4) frazione eluita. Si consiglia di analizzare il contenuto proteico del aliquote sopra mediante Western blotting utilizzando anticorpi anti-TAP o colorazione argento per riflettere l'efficienza di legame e eluizione di questo esperimento. Esempi di un gel colorato d'argento e una macchia sono mostrati in figura 1.
Dal SILAC ci fornisce le misure imparziale e quantificati di soci legame con le proteine, facciamo solo la prima fase della purificazione TAP per minimizzare la perdita del campione. Se si verifica una notevole quantità di legame non specifici, si consiglia di effettuare l'intero protocollo, che si trova nel Cold Spring Harbor manuale (4).
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References
- Loewen, C. J. Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization. Jour. Cell Biol. 179, 467-483 Forthcoming.
- Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics. Methods. 29, 124-130 Forthcoming.
- Puig, O. The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 Forthcoming.
- Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N.
