Summary
Hier beschreiben wir eine neue quantitative Proteomik Verfahren zur Identifizierung von Protein-Komplexen in Saccharomyces cerevisiae. In dieser Studie haben wir die SILAC-Methode zusammen mit Affinitätsreinigung durch Tandem-Massenspektrometrie gefolgt, um mit hoher Spezifität zu identifizieren die Bindungspartner einer ER-Protein, Scs2p verwendet.
Abstract
Lipide sind die Bausteine der Zellmembranen, die als Barrieren und in Abschottung von zellulären Prozessen, und vor kurzem, wie wichtig intrazellulären Signalmolekülen. Doch im Gegensatz zu Proteinen, Lipiden sind kleine hydrophobe Moleküle, dass der Verkehr vor allem durch schlecht beschrieben nonvesicular Routen, die die Hypothese aufgestellt, um an der Membran Kontaktstellen (MCS) auftreten. MCSs sind Regionen, in denen das endoplasmatische Retikulum (ER) ermöglicht den direkten körperlichen Kontakt mit einem Partner Organellen, zB Plasmamembran (PM). Die ER Teil des ER-PM MCSs ist in lipid-synthetisierenden Enzyme angereichert, was darauf hindeutet, dass Lipid-Synthese zu diesen Seiten gerichtet ist und was impliziert, dass MCSs wichtig sind für die Lipid-Verkehr. Hefe ist ein ideales Modell, um ER-PM MCSs wegen ihrer Fülle Studie mit über 1000 Kontakten pro Zelle, und ihre konservierte Natur in allen Eukaryoten. Das Aufdecken der Proteine, die MCSs bilden ist entscheidend für das Verständnis, wie Lipide Verkehr in Zellen erreicht wird, und wie sie wirken als Signalmoleküle. Wir haben festgestellt, dass ein ER genannt Scs2p zu ER-PM MCSs lokalisieren und ist für ihre Bildung wichtig. Wir sind auf die Aufdeckung der molekularen Partner Scs2p konzentriert. Identifizierung von Protein-Komplexen beruht traditionell auf der ersten Lösung gereinigtes Protein-Proben mittels Gelelektrophorese, durch In-Gel-Verdauung von Eiweiß Bands und Analyse von Peptiden durch Massenspektrometrie verfolgt. Diese oft Grenzen der Studie auf eine kleine Teilmenge von Proteinen. Außerdem werden Protein-Komplexe zu denaturieren oder nicht-physiologischen Bedingungen während des Verfahrens ausgesetzt. Um diese Probleme zu umgehen, haben wir eine groß angelegte quantitative Proteomics-Technik für eine objektive und quantifizierte Daten zu extrahieren umgesetzt. Wir verwenden stabile Isotopenmarkierung mit Aminosäuren in der Zellkultur (SILAC) zu heften Isotop Kerne in Proteine einzubauen in einem untagged Kontrollstamm. Gleiche Volumina getaggt Kultur und untagged, SILAC-markierten Kultur miteinander vermischt und lysiert durch Schleifen in flüssigem Stickstoff. Wir führen dann eine Affinität Reinigungsverfahren nach unten ziehen, Protein-Komplexen. Schließlich Niederschlag wir die Proteinprobe, die bereit sind für die Analyse durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie / Tandem-Massenspektrometrie ist. Am wichtigsten ist, sind Proteine in der Kontrolle Belastung durch das schwere Isotop markiert und wird eine Masse / Ladungs-Verschiebung, die gegen die unmarkierte Proteine in den Köder Belastung quantifiziert werden können, zu produzieren. Daher können Verunreinigungen oder unspezifische Bindung leicht beseitigt werden. Durch diesen Ansatz haben wir mehrere neue Proteine, die ER-MCSs PM lokalisieren identifiziert. Hier präsentieren wir Ihnen eine detaillierte Beschreibung unseres Ansatzes.
Protocol
Material und Methoden
- Hefestämme
- Alle Stämme in dieser Studie basieren auf der BY4742 Hintergrund. Der SILAC Kontrollstamm (Mat a, his3, leu2, ura3, lys2 und arg4: G418): bis BY4742 (Mat alpha wurde durch Paarung arg4 Löschung Stamm (: G418 Mat a, HIS3, URA3, LEU2 und arg4) gemacht his3, leu2, ura3 und lys2) und der meiotischen Haploiden wurden von Tetrade Dissektion erhalten. Daher ist die Kontrolle Stamm eine auxotroph für Lysin und Arginin. Der Köder Stamm wurde durch PCR-vermittelte homologe Rekombination mit dem Vektor pBS1479 gemacht. Daher ist die Epitop-Tag in dieser Studie verwendeten die Tandem-Affinitätsreinigung (TAP)-Tag (3).
- SILAC:
- Der SILAC Kontrolle Stamm wurde in minimal-Dropout-Medien mit 98% L-Lysin-4 ,4,5,5-D4 (0,03 g / L, Cambridge Isotope) und 98% L-Arginin-13 C 6 (ergänzt gewachsen 0,036 g / L, Cambridge Isotope).
- Der Köder Stamm wurde in regelmäßigen Vollmedium mit normaler Isotopenzusammensetzung Aminosäuren gewachsen.
- Erste Stufe der TAP Reinigung [Dieses Protokoll wird von der Cold Spring Harbor Laboratory Kurs-Handbuch (4) angepasst]
** Die Nacht vor Ihrer Reinigung, pre-chill Mörser und Stößel in -80 ° C Gefrierschrank. Auch vor Kälte einen Becher in -20 ° C **
Machen Sie diese Puffer kurz vor Gebrauch (für 1 l Kultur):- 30 ml NP-40-Puffer mit 25 ul PIC (1 / 2000), 50 &mgr; l 1 M DTT
- 20 ml der NP-40-Puffer mit 1 / 200 PIC, 50 ul 1M DTT
- 10 ml der TEV-C-Puffer mit 1 / 2000 PIC, 10 ul 1 M DTT
SILAC und Vorbereitung
- Wachsen 1L jeder der Köder Belastung und der Kontrolle getrennt Stamm OD 600 = 1,0 bis 1,3.
- Gießen Kultur in 500ml Nalgene Zentrifugenröhrchen. Balance der Last-und Pellet-Zellen bei 2580X g.
- Dekantieren Medien-und Pellet mit 50 ml kaltem dH 2 O während der Übertragung der Zellen zu 50ml Zentrifugenröhrchen. Pellet-Zellen. ** Sie können das Pellet bei -80 ° C einzufrieren **
- ** Wichtig ** entsprechen der Kontrollstamm Kultur, um den Köder Stammkultur in 1:1 durch trockene Pellet Gewicht.
- Resuspendieren jedem Zellpellet in 10 ml NP-40-Puffer mit 1 / / 2.000 Protease Inhibitor Cocktail (PIC).
- Mix der beiden Zellkulturen durch direkt Umfüllen einer Röhre in die andere.
Mahlen - Gießen Sie flüssigem N 2 in die vorgekühlten Mörser und lassen Sie es vollständig verdampfen. 2 ml der Zellen, um den Mörtel in kreisenden Bewegungen. Gießen Sie etwas flüssigem N 2, um die Zellen einzufrieren. Grind die Zellen, bis die Zellen feines Pulver zu werden. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Zellen Boden sind. ** Nicht in die Zellen zu tauen. Fügen Sie flüssigem N 2 bei Bedarf **
- Übertragen Sie die Pulver zu einem eiskalten Becher und bei Raumtemperatur auftauen. Wenn die Kanten zu tauen beginnt, 20 ml NP-40-Puffer mit 1 / 200 PIC.
- Transfer Rohlysat bis 40-ml Nalgene Röhrchen. Spin bei 39000 xgfor 30 min.
- Während der Wartezeit, nehmen Sie 300 ul Sepharose 2B-Beads (GE). Waschen Sie die Perlen in 300 ul NP-40 Puffer (2.1, 000 PIC) 3 mal. Resuspendieren der Beads in 300 ul Puffer, so dass sie in 1:1 Aufschlämmung.
Pre-Clearing-Zelllysat - Übertragen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen und fügen Sie die Sepharose 2B Perlen. Inkubieren auf einer rotierenden Plattform in Kühlraum für 30 min.
- Während der Wartezeit, nehmen Sie 300 ul IgG Sepharose 6 Beads (GE). Waschen Sie die Perlen in 300 ul NP-40 Puffer (2.1, 000 PIC) 3 mal. Resuspendieren der Beads in 300 _l-Puffer, so dass sie in 1:1 Aufschlämmung.
- Pellet der Perlen. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen. ** Speichern ein Aliquot von dem Zelllysat für Western Blotting später **
Die Bindung an IgG-Sepharose beads - Entfernen Sie die Sepharose 2B Perlen durch Zentrifuge. Fügen Sie die IgG-Beads (zuvor in 1:1 Aufschlämmung hergestellt). Trennen Sie die Inhalte in zwei Röhren für effizientere bindend. Inkubieren auf einer rotierenden Plattform in kalten Raum für 2 Stunden.
- Spin down der Perlen. ** Speichern einen aliquoten Teil der ungebundenen Fraktion **
- Wash-Kügelchen mit 10 ml NP-40 Puffer (2.1, 000 PIC).
- Wash Perlen mit 3 ml TEV-C-Puffer (2.1, 000 PIC). ** Speichern einen aliquoten Teil der Perlen. Darin soll die Effizienz der Bindung **
Eluting von IgG Beads durch TEV-Protease-Spaltung - Add 5 ul AcTEV zu 1 ml TEV-C-Puffer (mit 1 / 2, 000 PIC). Nach dem Mischen, trennen Sie die Inhalte in zwei 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen für eine effizientere Vermischung. Inkubieren auf einer rotierenden Plattform im Kühlraum über Nacht.
- Spin down die Perlen und den Transfer des Eluats in ein frisches 1,5-ml-Tube. Waschen Sie die Perlen mit zusätzlichen 0,5 ml TEV-C-Puffer
- Kombinieren Sie die elaute in einem Rohr. Sie sollten 1,5 ml Eluat insgesamt haben.** Speichern einen aliquoten Teil der TEV Eluat **
Trichloressigsäure (TCA) precipatation (für die Massenspektrometrie-basierte Analyse, empfehlen wir die Verwendung EtOH / Acetat-Fällung) - Passen Aliquots zu 25% TCA mit 100% TCA. Um dies zu tun, trennen Sie die 1,5 ml Eluat in 2 Röhren von 750 ul jeder. Add 250 ul 100% TCA auf das Rohr. Ihre Lösung sollte milchig.
- Auf Eis für 30 min mit periodischen Vortexen.
- Spin bei maximaler Geschwindigkeit in der Tischzentrifuge in Kühlraum für 30 min.
- Wash einmal mit 500 ul eiskaltem Aceton mit 0,05 N HCl und Spin für 5 min bei maximaler Geschwindigkeit (Kühlraum).
- Wash einmal mit 500 ul eiskaltem Aceton und Spin für 5 min bei max (Kühlraum).
- Entfernen Sie vorsichtig Aceton und trockene Pellets.
- Für Silber-Färbung, das Pellet in 50 ul 1X SDS-Probenpuffer.
EtOH / Acetat precipatation - Fügen Sie 20 g Glykogen
- Verdünnen Sie die Proben mit 5x 100% EtOH und passen zu 50 mM NaCH 3 COO mit einer 2,5 M Stammlösung, pH 5,0,
- Stellen Sie die Lösung für 2h
- Pellet ausgefallene Protein durch Zentrifugation für 10 min bei 12.000 X g bei Raumtemperatur.
NP-40 Puffer (200 ml)
| Lager-Konzentration | Hinzufügen | |
| 10 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,2) | 0,1 M | 20 ml |
| 150 mM NaCl | 2 M | 15 ml |
| 1% NP-40 | 100% | 2 ml |
| 50 mM NaF | 1 M | 10 ml |
| 0,1 mM Na 3 VO 4 | 10 mM | 2 ml |
| Volume auf 200 ml | ||
ADD vor dem Gebrauch:
- 1 / 1, 000 von 1 M DTT
- 1 / 2, 000 von PIC (Protease-Inhibitoren Cocktail)
TEV-C-Puffer (für 50 ml)
| Lager-Konzentration | Hinzufügen | |
| 25 mM Tris (pH 8,0) | 100 mM | 12,5 ml |
| 150 mM NaCl | 2 M | 3,75 ml |
| 0,1% NP-40 | 100% | 50 _l |
| 0,5 mM EDTA | 500 mM | 50 __l |
| Volumen von 50 ml | ||
ADD vor dem Gebrauch:
- 1 / 1, 000 1M DTT
- 1 / 2, 000 PIC
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Discussion
Die Aliquots während der Reinigungsprozedur gespeichert werden sollen umfassen (1) mit bereits geklärten Zelllysat, (2) gebundenen Fraktion (3), ungebundene Fraktion, und (4) eluierte Fraktion. Wir empfehlen die Analyse der Protein Inhalt der oben Aliquots durch Western-Blot mit anti-TAP-Antikörper oder Silberfärbung, die Bindung und Elution Effizienz des Experiments zu reflektieren. Beispiele für eine mit Silber gefärbten Gel und ein Schandfleck sind in Abbildung 1 dargestellt.
Da SILAC bietet uns unvoreingenommen und quantifiziert Messungen von Protein-Bindung Partnern werden wir nur die erste Stufe des TAP Reinigung zu Probe zu minimieren. Wenn Sie große Mengen an unspezifische Bindung Erfahrung, können Sie für die Durchführung der gesamten Protokoll, das in der Cold Spring Harbor-Handbuch (4) gefunden werden kann.
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References
- Loewen, C. J. Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization. Jour. Cell Biol. 179, 467-483 Forthcoming.
- Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics. Methods. 29, 124-130 Forthcoming.
- Puig, O. The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 Forthcoming.
- Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 123-125 Forthcoming.
