Summary
כאן אנו מתארים טכניקה חדשה proteomics כמותיים לזיהוי מתחמי חלבון cerevisiae Saccharomyces. במחקר הנוכחי, השתמשנו בשיטה SILAC יחד עם טיהור זיקה ואחריו טנדם ספקטרומטריית מסה להזדהות עם סגוליות גבוהה השותפים המחייב של חלבון ER, Scs2p.
Abstract
ליפידים הם אבני הבניין של ממברנות הסלולר המתפקדים מחסומים ועל מידור של תהליכים תאיים, ולאחרונה, כפי חשוב מולקולות איתות תאיים. עם זאת, בניגוד חלבונים, שומנים הם מולקולות הידרופוביות קטנות תעבורה בעיקר על ידי נתיבי nonvesicular תיאר גרוע, שהם שיערו להתרחש בכל מגע אתרים קרום (MCSs). MCSs הם אזורים שבהם reticulum endoplasmic (ER) עושה מגע פיזי ישיר עם אברון משתפת פעולה, למשל, פלזמה הממברנה (PM). החלק המיון של ER-PM MCSs הוא מועשר ב שומנים לסנתז אנזימים, טוען כי סינתזה השומנים מופנית לאותם אתרים רומז כי MCSs חשובים תנועה השומנים. שמרים הוא מודל אידיאלי ללמוד ER-PM MCSs בגלל השפע שלהם, עם למעלה מ 1000 אנשי קשר לכל תא, טבע נשמרת שלהם כל אאוקריוטים. חשיפת חלבונים המהווים MCSs הוא קריטי כדי להבין כיצד תנועה שומנים נעשית בתאים, וכיצד הם פועלים כמו מולקולות איתות. מצאנו כי ER נקרא Scs2p למקם את ER-PM ו MCSs חשוב היווצרותם. אנו מתמקדים בחשיפת השותפים המולקולרי של Scs2p. זיהוי של קומפלקסים חלבונים מסורתי מסתמך על הראשון לפתרון דגימות חלבון מטוהרים על ידי ג'ל אלקטרופורזה, ואחריו עיכול ג'ל של להקות החלבון ואנליזה של פפטידים על ידי ספקטרומטריית מסה. זה לעתים קרובות מגביל את לימוד בקבוצה קטנה של חלבונים. כמו כן, קומפלקסים חלבונים נחשפים denaturing או לא תנאים פיזיולוגיים במהלך ההליך. כדי לעקוף את הבעיות הללו, יישמנו בקנה מידה גדול טכניקה proteomics כמותיים כדי לחלץ נתונים משוחדת לכמת. אנו משתמשים תיוג איזוטופ יציב עם חומצות אמינו תרבית תאים (SILAC) לשלב גרעינים איזוטופ מצרך חלבונים זן פקד לא מתוייגת. כמויות שוות של התרבות מתויג לא מתוייגת, תרבות SILAC שכותרתו מעורבבים יחד lysed על ידי שחיקה של חנקן נוזלי. לאחר מכן, אנו לבצע הליך טיהור זיקה לנתץ קומפלקסים חלבונים. לבסוף, אנו לזרז את המדגם חלבון, שהוא מוכן לניתוח על ידי כרומטוגרפיה ביצועים גבוהים נוזלי / ספקטרומטריית מסה טנדם. והחשוב מכל, חלבונים זן הבקרה מסומנים על ידי האיזוטופ הכבד יהיה לייצר שינוי מסה / מטען, כי ניתן לכמת נגד חלבונים ללא תווית בזן את הפיתיון. לכן, מזהמים, או מחייב נוקבים ניתן לבטל בקלות. על ידי שימוש בגישה זו, זיהינו חלבונים הרומן מספר למקם את ER-PM MCSs. כאן אנו מציגים תיאור מפורט של הגישה שלנו.
Protocol
חומרים ושיטות
- זני שמרים
- כל הזנים המשמשים במחקר זה מבוססים על רקע BY4742. זן השליטה SILAC (מחצלת, his3, leu2, ura3, lys2 ו arg4: G418) נעשתה על ידי הזדווגות arg4 זן המחיקה (מחצלת, his3, ura3, leu2 ו arg4: G418) כדי BY4742 (מאט אלפא, his3, leu2, ura3 ו lys2), ואת haploids meiotic התקבלו על ידי לנתיחה הטטרדה. לכן, את המתח שליטה auxotroph עבור ליזין ארגינין. זן הפיתיון נעשה על ידי רקומבינציה הומולוגיים PCR בתיווך באמצעות וקטור pBS1479. לכן, תג epitope השתמשו במחקר זה הוא טיהור זיקה טנדם (TAP) תג (3).
- SILAC:
- זן השליטה SILAC היה גדל בתקשורת הנשירה מינימלי בתוספת 98% L-ליזין-4 ,4,5,5-D4 (0.03 g / L, קיימברידג' איזוטופ) ו 98% L-ארגנין-13 C 6 (0.036 גרם / L, קיימברידג' איזוטופ).
- זן הפיתיון היה גדל במדיום עשיר קבוע עם נורמלי חומצות אמינו איזוטופי.
- שלב ראשון של טיהור TAP [פרוטוקול זה מותאם ממעיין הקרה הרבור מעבדה כמובן ידנית (4)]
** בלילה שלפני מרגמה טיהור שלך מראש צמרמורת, ועלי ב -80 ° C במקפיא. כמו כן, מראש צמרמורת הגביע ב -20 ° C **
בצע מאגרים אלה ממש לפני השימוש (עבור L 1 של התרבות):- 30 מ"ל NP-40 חיץ עם PIC 25 μl (1 / 2000), 50 μl של DTT 1M
- 20 מ"ל של חיץ NP-40 עם 1 / 200 PIC, 50 μl של 1M DTT
- 10 מ"ל של TeV-C חיץ עם PIC 1 / 2000, 10 μl של 1 M DTT
SILAC והכנת
- לגדול 1L כל זן את הפיתיון השליטה זן בנפרד OD 600 = 1.0-1.3.
- יוצקים תרבות 500ml צינורות Nalgene צנטריפוגות. מאזן את העומס ותאי גלולה ב 2580X g.
- למזוג מדיה resuspend גלולה עם 50 מ"ל של קר DH 2 O תוך העברת התאים 50 מ"ל צינורות צנטריפוגות. גלולה תאים. ** ניתן להקפיא את גלולה ב -80 ° C **
- ** ** חשוב להתאים את התרבות זן לשלוט לתרבות הפיתיון המתח 01:01 על ידי גלולה משקל יבש.
- Resuspend כל תא גלולה ב 10 מ"ל של חיץ NP-40 עם קוקטייל 1 / / 2000 מעכבי פרוטאז (PIC).
- מערבבים את שתי התרבויות תא decanting ישירות על ידי שפופרת אחת לשנייה.
שחיקה - יוצקים את נוזלי N 2 לתוך מרגמה מראש צינן את ולאפשר לו להתאדות לגמרי. הוסף 2 מ"ל של תאים מרגמה בתנועה מעגלית. יוצקים מעט נוזלי N 2 להקפיא את התאים. טוחנים את התאים עד התאים להיות אבקה דקה. חזור על התהליך עד שכל התאים הקרקע. ** אל תאפשר התאים להפשיר. הוסף נוזלי N 2 בעת הצורך **
- מעבירים את אבקת כוס מי קרח ו להפשיר בטמפרטורת החדר. כאשר הקצוות מתחילים להפשיר, להוסיף 20 מ"ל של חיץ NP 40-PIC עם 1 / 200.
- העברת lysate גולמי של 40 מ"ל צינורות Nalgene. ספין על xgfor 39,000 30 דקות.
- בזמן ההמתנה, לקחת 300 μl של חרוזים Sepharose 2B (GE). לשטוף את החרוזים 300 μl של חיץ NP-40 (1 / 2, 000 PIC) 3 פעמים. Resuspend את החרוזים חיץ 300 μl כך שהם slurry 01:01.
טרום ניקוי התא lysate - מעבירים את supernatant לצינור חדש ולהוסיף את החרוזים 2B Sepharose. לדגור על פלטפורמה מסתובבת בחדר קר למשך 30 דקות.
- בזמן ההמתנה, לקחת 300 μl של IgG Sepharose 6 חרוזים (GE). לשטוף את החרוזים 300 μl של חיץ NP-40 (1 / 2, 000 PIC) 3 פעמים. Resuspend את החרוזים חיץ 300 _l כך שהם slurry 01:01.
- גלולה את החרוזים. מעבירים את supernatant לצינור חדש. ** שמור aliquot של lysate התא עבור המערבי סופג מאוחר יותר **
הכבילה למעסיק חרוזים IgG sepharose - הסר את החרוזים 2B Sepharose על ידי צנטריפוגה. מוסיפים את החרוזים IgG (הכין בעבר slurry 1:1). הפרד את התוכן לשני צינורות עבור מחייב יותר יעיל. לדגור על פלטפורמה מסתובבת בחדר קר עבור שעה 2.
- ספין את החרוזים. ** שמור aliquot סיעת מאוגד **
- לשטוף עם חרוזים חיץ 10 NP-40 מ"ל (1 / 2, 000 PIC).
- לשטוף חרוזים עם 3 מ"ל TeV-C חיץ (1 / 2, 000 PIC). ** שמור aliquot של החרוזים. זה ישקף את היעילות של ** מחייב
משחררי מן החרוזים IgG ידי מחשוף פרוטאז TeV - הוסף 5 μl של AcTEV למאגר 1ml של TeV-C (עם PIC 02/01 000,). לאחר ערבוב, להפריד את התוכן לשני צינורות 1.5 מ"ל Eppendorf יותר ערבוב יעיל. לדגור על פלטפורמה מסתובבת בחדר קר הלילה.
- ספין למטה חרוזים העברת eluate לצינור 1.5-מ"ל טריים. שטפו את החרוזים עם 0.5 מ"ל נוספים של TeV-C חיץ
- מערבבים את elaute בצינור אחד. היית צריך 1.5 מ"ל של eluate בסך הכל.** שמור aliquot של eluate TeV **
חומצה Trichloroacetic (TCA) precipatation (לניתוח ספקטרומטריית מסה מבוססות, אנו ממליצים להשתמש EtOH / משקעים אצטט) - התאם aliquots 25% TCA עם 100% TCA. כדי לעשות זאת, להפריד את eluate 1.5 מ"ל לתוך 2 צינורות של μl 750 כל אחד. הוסף 250 μl של 100% TCA אל הצינור. הפתרון שלך צריך להפוך חלבי.
- מניחים על קרח למשך 30 דקות עם vortexing תקופתיות.
- ספין במהירות מקסימלית בצנטריפוגה שולחן בראש בחדר קר למשך 30 דקות.
- שטפי פעם עם 500 μl של אצטון קר כקרח המכיל 0.05 N HCl ו - ספין של 5 דקות במהירות מקסימלית (חדר קר).
- שטפי פעם עם 500 μl של אצטון קרים כקרח ספין 5 דקות על מקסימום (חדר קר).
- מוציאים בזהירות אצטון גלולה יבש.
- עבור מכתים כסף, resuspend את הכדור ב 50 μl של חיץ מדגם SDS 1X.
EtOH / אצטט precipatation - הוסף 20 מיקרוגרם של גליקוגן
- מדולל דגימות 5X עם EtOH 100% להסתגל 50 מ"מ נ"ך 3 COO עם מלאי M 2.5, pH 5.0
- Stand הפתרון 2hr
- גלולה זירז חלבון על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות על 12,000 X גרם בטמפרטורת החדר.
NP-40 חוצץ (עבור 200 מ"ל)
| במלאי ריכוז | להוסיף | |
| 10 mM נתרן זרחתי חיץ (pH 7.2) | 0.1 מ ' | 20 מ"ל |
| 150 mM NaCl | 2 M | 15 מ"ל |
| 1% NP-40 | 100% | 2 מ"ל |
| 50 מ"מ NAF | 1 M | 10 מ"ל |
| 0.1 mM Na 3 VO 4 | 10 mM | 2 מ"ל |
| נפח עד 200 מ"ל | ||
ADD לפני השימוש:
- 1 / 1, 000 של 1 M DTT
- 1 / 2, 000 של PIC (קוקטייל מעכבי פרוטאז)
TeV-C חוצץ (עבור 50 מ"ל)
| במלאי ריכוז | להוסיף | |
| 25 מ"מ טריס (pH 8.0) | 100 מ"מ | 12.5 מ"ל |
| 150 mM NaCl | 2 M | 3.75 מ"ל |
| 0.1% NP-40 | 100% | 50 _l |
| 0.5 mM EDTA | 500 מ"מ | 50 __l |
| נפח עד 50 מ"ל | ||
ADD לפני השימוש:
- 1 / 1, 000 של 1M DTT
- 1 / 2, 000 של PIC
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aliquots הציל במהלך ההליך טיהור צריכה לכלול (1) מראש פינה lysate התא, (2) חלק מחויב, (3) חלק מאוגד, ו (4) חלק eluted. אנו ממליצים על ניתוח תוכן של חלבון aliquots לעיל על ידי המערב סופג באמצעות נוגדן אנטי מכתים TAP או כסף כדי לשקף את היעילות מחייב משחררי הניסוי. דוגמאות של ג'ל מוכתם כסף כתם מוצגים באיור 1.
מאז SILAC מספק לנו מדידות משוחדת לכמת השותפים חלבון מחייב, אנחנו רק עושים את השלב הראשון של טיהור TAP כדי להקטין את איבוד המדגם. אם אתה נתקל כמויות משמעותיות של מחייב נוקבים, מומלץ לבצע את הפרוטוקול כולו, אשר ניתן למצוא ב Cold Spring Harbor ידני (4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Loewen, C. J. Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization. Jour. Cell Biol. 179, 467-483 Forthcoming.
- Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics. Methods. 29, 124-130 Forthcoming.
- Puig, O. The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 Forthcoming.
- Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N.
