Summary
Здесь мы опишем новые количественные техники протеомики для идентификации белковых комплексов в CEREVISIAE Saccharomyces. В данном исследовании мы использовали метод SILAC вместе с аффинной очистки следует тандемной масс-спектрометрии для определения с высокой специфичностью обязательными партнерами ER белков, Scs2p.
Abstract
Липиды являются строительным материалом клеточных мембран, которые функционируют как барьеров и дробления клеточных процессов, а в последнее время, в качестве важных внутриклеточных сигнальных молекул. Однако, в отличие от белков, липидов небольшие гидрофобные молекулы, что трафик прежде всего плохо описываются nonvesicular маршрутов, которые предположили, происходит на мембранных контактов сайтов (СМКС). СМКС регионы, где эндоплазматический ретикулум (ER) делает прямого физического контакта с партнерских органелл, например, плазматической мембраны (ПМ). ER часть ЭР-ПМ СМКС обогащается липидами синтеза ферментов, предполагая, что синтез липидов направлена на эти сайты и подразумевая, что СМКС важны для липидной трафика. Дрожжи идеальной моделью для изучения ЭР-ПМ СМКС из-за их изобилия, с более чем 1000 контактов в клетке, и их сохранения природы во всех эукариот. Раскрытие белки, которые составляют СМКС имеет решающее значение для понимания того, как липиды трафика осуществляется в клетках, и как они действуют в качестве сигнальных молекул. Мы обнаружили, что ER называется Scs2p локализовать к ER-ПМ СМКС и имеет важное значение для их формирования. Мы ориентированы на выявление молекулярно партнеров Scs2p. Идентификация белковых комплексов традиционно основывается на решении первой очищенных образцов белка помощью гель-электрофореза, а затем в-гель переваривание белка полосы и анализа пептидов, масс-спектрометрии. Это часто ограничивает исследования небольшой группы белков. Кроме того, белковые комплексы подвергаются денатурации или не-физиологических условиях во время процедуры. Чтобы обойти эти проблемы, мы осуществили крупномасштабные количественные техники протеомики для извлечения объективной и количественных данных. Мы используем стабильные маркировки изотопа с аминокислотами в культуре клеток (SILAC) включить основных ядер изотопа в белки в немаркированные напряжение управления. Равные объемы меченых культуры и немаркированные, SILAC меченных культуры смешиваются и лизированных путем измельчения в жидком азоте. Затем проводят процедуры аффинной очистки снести белковых комплексов. Наконец, мы осадок белка образца, который готов для анализа высокопроизводительной жидкостной хроматографии / тандемной масс-спектрометрии. Самое главное, белки контрольного штамма помечены тяжелого изотопа и будет производить масса / заряд сдвиг, который может быть определена количественно против немеченого белков в приманку напряжения. Таким образом, загрязнители, или неспецифических связывание может быть легко устранена. Используя этот подход, мы выделили несколько белков, роман, который локализуется ЭР-ПМ СМКС. Здесь мы приводим подробное описание нашего подхода.
Protocol
Материалы и методы
- Штаммов дрожжей
- Все штаммы, используемые в настоящем исследовании, основаны на BY4742 фоне. Напряжение SILAC контроля (Мат, his3, leu2, URA3, lys2 и arg4:: G418) был сделан в результате скрещивания arg4 удаление штамма (Мат, his3, URA3, leu2 и arg4:: G418), чтобы BY4742 (Мф. альфа, his3, leu2, URA3 и lys2) и мейоза гаплоидов были получены с помощью тетрадного вскрытие. Таким образом, контроль деформации ауксотроф для лизина и аргинина. Приманки напряжение было сделано с помощью ПЦР-опосредованной гомологичной рекомбинации с помощью векторного pBS1479. Таким образом, эпитопа теги, используемые в данном исследовании является очищение тандеме сродством (TAP) тэг (3).
- SILAC:
- Напряжение SILAC контроль был выращен на минимальных средах отсева дополнена с 98% L-лизин-4 ,4,5,5-D4 (0,03 г / л, Кембридж Изотопный) и 98% L-аргинин-13 C 6 (0.036 г / L, Кембридж Изотопный).
- Приманки штамм был выращен в регулярном богатой среде с нормальным изотопным аминокислот.
- Первый этап очистки водопроводной [Этот протокол адаптирован из лаборатории Колд Спринг Харбор курс руководства (4)]
** Ночь перед очисткой, предварительно холод ступки и пестика в -80 ° C морозильнике. Кроме того, предварительное охлаждение стакан в -20 ° C **
Сделать эти буферы непосредственно перед использованием (на 1 л культуры):- 30 мл NP-40 буфер с 25 мкл ПОС (1 / 2000), 50 мкл 1М DTT
- 20 мл NP-40 буфер с 1 / 200 ПОС, 50 мкл 1М DTT
- 10 мл ТРВ-C буфера с 1 / 2000 ПОС, 10 мкл 1 М ДТТ
SILAC и подготовка
- Расти 1L каждого штамма приманку и контрольного штамма отдельно OD 600 = 1,0-1,3.
- Залить 500 мл культуры в центрифужные пробирки Nalgene. Баланс нагрузки и гранул клеток 2580X г.
- Декантировать СМИ и ресуспендирования гранул с 50 мл холодного дН 2 O при переносе клеток на 50 мл пробирки центрифуги. Гранул клеток. ** Вы можете заморозить гранул при температуре -80 ° C **
- ** ** Важных матча культуры контрольного штамма к культуре приманки напряжение в 1:01 по сухому весу гранул.
- Ресуспендируют каждый осадок клеток в 10 мл NP-40 буфер с 1 / / 2000 Коктейль ингибитор протеазы (ПОС).
- Смешайте два клеточных культур непосредственно декантации одной галереи в другую.
Измельчение - Залить жидким N 2 в предварительно охлажденный раствор и дайте ему полностью испариться. Добавить 2 мл клеток раствора в круговом движении. Налейте немного жидкого N 2 для замораживания клеток. Grind клетки до клетки становятся мелкий порошок. Повторите процесс, пока все клетки земли. ** Не позволяйте клетки таять. Добавить жидкость N 2 при необходимости **
- Передача порошка ледяной стакан и оттаивают при комнатной температуре. Когда края начинают таять, добавить 20 мл NP-40 буфер с 1 / 200 ПОС.
- Передача сырой лизат до 40-мл Nalgene труб. Спиновые на 39000 xgfor 30 мин.
- В ожидании, возьмите 300 мкл Sepharose бисером 2B (GE). Вымойте бисером в 300 мкл NP-40 буфер (1 / 2, 000 ПОС) 3 раза. Ресуспендируют бисером в 300 мкл буфера, так что они в суспензию 1:1.
Предварительная очистка Клеточный лизат - Передача супернатант в новую пробирку и добавить бисер Sepharose 2B. Инкубировать на вращающейся платформе в холодном помещении в течение 30 мин.
- В ожидании, возьмите 300 мкл IgG Sepharose 6 шариков (GE). Вымойте бисером в 300 мкл NP-40 буфер (1 / 2, 000 ПОС) 3 раза. Ресуспендируют бисером в 300 _l буфера так, чтобы они в суспензию 1:1.
- Гранул бисером. Передача супернатант в новую пробирку. ** Сохранить аликвоту Клеточный лизат для Западной Blotting позже **
Привязка к IgG сефарозе бисером - Удалить Sepharose бисером 2B на центрифуге. Добавить IgG шарики (заранее подготовленные в 1:01 шлам). Отдельные содержимое в две трубки для более эффективного связывания. Инкубировать на вращающейся платформе в холодном помещении в течение 2 часов.
- Спином вниз бисером. ** Сохранить аликвоту несвязанные фракции **
- Вымойте бусин с 10 мл NP-40 буфер (1 / 2, 000 ПОС).
- Вымойте бусины с 3 мл ТРВ-С буфером (1 / 2, 000 ПОС). ** Сохранить аликвоты бусин. Это будет отражать эффективность связывания **
Доставляющий из бисера IgG при расщеплении протеазы TEV - Добавьте 5 мкл AcTEV в 1 мл ТРВ-C буфер (с 1 / 2, 000 ПОС). После смешивания отдельных содержимое на две 1,5 мл пробирок Эппендорф для более эффективного смешения. Инкубировать на вращающейся платформе в холодной комнате на ночь.
- Спином вниз бисером и передачи элюата на свежий 1,5-мл трубки. Вымойте бусин с дополнительными 0,5 мл ТРВ-С буфером
- Комбинат elaute в одной трубе. Вы должны иметь 1,5 мл элюата в общей сложности.** Сохранить аликвоту TEV элюата **
Трихлоруксусной кислоты (TCA) precipatation (для масс-спектрометрии основе анализа, мы рекомендуем использовать этанол / этилацетат осадков) - Отрегулируйте аликвот до 25% ТСА со 100% TCA. Чтобы сделать это, отдельные 1,5 мл элюата на 2 трубы в 750 мкл. Добавить 250 мкл 100% TCA к трубе. Ваше решение должно очередь молочного.
- Место на льду в течение 30 минут с периодическими вортексе.
- Спиновые на максимальной скорости в настольной центрифуге в холодном помещении в течение 30 мин.
- Вымойте раз с 500 мкл ледяной ацетон, содержащих 0,05 N HCl и спина в течение 5 мин при максимальной скорости (холодное помещение).
- Вымойте раз с 500 мкл ледяной ацетон и спина в течение 5 мин при максимальной (холодное помещение).
- Осторожно снимите ацетона и сухого гранул.
- Для окрашивания серебром, ресуспендируют гранул в 50 мкл буфера 1X образец SDS.
EtOH / ацетат precipatation - Добавьте 20 мкг гликогена
- Разбавьте образцы 5 раз со 100% этанола и настроить до 50 мм нах 3 COO с 2,5 М состава, рН 5,0
- Стенд решение для 2hr
- Гранул осажденный белок центрифугированием в течение 10 мин при 12000 X г при комнатной температуре.
NP-40 буфер (на 200 мл)
| Сток концентрации | Добавлять | |
| 10 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,2) | 0,1 М | 20 мл |
| 150 мМ NaCl | 2 M | 15 мл |
| 1% NP-40 | 100% | 2 мл |
| 50 мМ NaF | 1 M | 10 мл |
| 0,1 ммоль Na 3 VO 4 | 10 мМ | 2 мл |
| Тома до 200 мл | ||
ДОБАВИТЬ перед использованием:
- 1 / 1, 000 1 М ДТТ
- 1 / 2, 000 ПОС (ингибиторы протеаз коктейль)
ТРВ-C Буфер (на 50 мл)
| Сток концентрации | Добавлять | |
| 25 мМ трис (рН 8,0) | 100 мМ | 12,5 мл |
| 150 мМ NaCl | 2 M | 3,75 мл |
| 0,1% NP-40 | 100% | 50 _l |
| 0,5 мМ ЭДТА | 500 мМ | 50 __l |
| Тома до 50 мл | ||
ДОБАВИТЬ перед использованием:
- 1 / 1, 000 1М DTT
- 1 / 2, 000 ПОС
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Аликвоты сохраняются при очистке процедуры должны включать в себя (1) предварительно очищен Клеточный лизат, (2) связанной фракции, (3) несвязанные фракции, и (4) элюировали фракцию. Мы рекомендуем проанализировать содержание белка выше аликвоты западных промокательной с использованием анти-TAP антитела или окрашивания серебром, чтобы отразить обязательными и элюированием эффективность эксперимента. Примеры серебра окрашивали гель и пятно показаны на рисунке 1.
С SILAC дает нам объективную и количественные измерения связывания с белками партнеров, мы делаем только первый этап очистки водопроводной, чтобы минимизировать потери образца. Если у вас возникли значительные количества неспецифического связывания, вы можете провести весь протокол, который можно найти в Колд Спринг Харбор руководство (4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Loewen, C. J. Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization. Jour. Cell Biol. 179, 467-483 Forthcoming.
- Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics. Methods. 29, 124-130 Forthcoming.
- Puig, O. The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 Forthcoming.
- Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N.
