Summary
여기 Saccharomyces cerevisiae의에서 단백질 단지를 식별하기위한 새로운 양적 proteomics 기술을 설명합니다. 본 연구에서는, 우리는 높은 특이성과 ER 단백질 Scs2p의 바인딩 파트너를 식별하는 탠덤 질량 분석계 다음 친화 정화와 함께 SILAC 방법을 사용했습니다.
Abstract
Lipids 중요한 세포 신호 전달 분자로, 최근에는 장벽로서 세포 프로세스 compartmentalization에서 세포 세포막 그 함수의 빌딩 블록이며,. 그러나, 단백질과는 달리, lipids 작은 소수성 분자는 것을 주로 막 연락처 사이트 (MCSs)에서 발생하는 가상 아르 제대로 설명 nonvesicular 경로로 트래픽. MCSs는 endoplasmic reticulum (ER)가 제휴 organelle, 예를 들어, 플라즈마 멤브레인 (PM)와 직접적인 신체 접촉을 만드는 지역입니다. ER - PM MCSs의 ER 부분은 그 지질 합성이 해당 사이트로 이동하고 MCSs는 지질 트래픽 중요하다는 것을 뜻합니다 제안, 지질 합성 효소에 풍부합니다. 효모는 1000 셀 당 연락처 및 모든 eukaryotes에서 보존 자연과, 때문에 그들의 풍요의 ER - PM MCSs를 공부하는 이상적인 모델입니다. MCSs을 구성하는 단백질을 잠복하면 lipids 트래픽이 세포에 달성하는 방법 이해하는 것이 중요합니다, 그들은 신호 분자 역할을하는 방법. 우리는 Scs2p라는 ER은 ER - 오후 MCSs에 집중 발견과 형성에 중요합니다. 우리는 Scs2p의 분자 파트너 잠복에 초점을 맞추고 있습니다. 단백질 단지의 확인은 전통적으로 첫번째 질량 분광법에 의해 펩티드의 단백질 밴드와 분석에 - 젤 소화 다음 겔 전기 영동에 의해 정제된 단백질 샘플을 해결에 의존합니다. 이것은 종종 단백질의 작은 하위 집합에 대한 연구를 제한합니다. 또한, 단백질 단지는 절차를 수행하는 동안 denaturing 또는 이외의 생리 조건에 노출되어 있습니다. 이러한 문제를 회피하기 위해, 우리는 편견과 계량 데이터를 추출하기 위해 대규모 양적 proteomics 기술을 구현했습니다. 우리는 태그가 지정되지 않은 제어 변형에 단백질의 주요 동위 원소의 핵을 통합하기 위해 세포 배양에서 아미노산 (SILAC)와 안정 동위 원소 라벨을 사용합니다. 태그 문화와 태그가 지정되지 않은, SILAC - 레이블 문화의 동등 권 함께 혼합하여 액체 질소에 연삭에 의해 lysed 있습니다. 그러면 단백질 단지를 잡아 친화 정화 절차를 수행합니다. 마지막으로, 우리는 고성능 액체 크로마 토그래피 / 탠덤 질량 분석계로 분석을위한 준비가 단백질 샘플을 촉진. 가장 중요한 것은, 제어 변형에 단백질은 무거운 동위 원소에 의해 표시되고 미끼 변형에 레이블이 지정되지 않은 단백질에 대한 계량 수있는 질량 / 비용 변화를 생산합니다. 따라서, 오염 물질, 또는 unspecific 바인딩을 쉽게 제거하실 수 있습니다. 이 접근법을 사용함으로써, 우리는 ER - 오후 MCSs에 집중 여러 소설 단백질을 발견했습니다. 여기 우리는 우리의 접근 방법에 대한 자세한 설명을 제시한다.
Protocol
재료 및 방법
- 효모 종자
- 이 연구에 사용된 모든 종자는 BY4742 배경에 근거하고 있습니다. SILAC 제어 스트레인 (매트, his3, leu2, ura3, lys2 및 arg4 : G418)는 : BY4742 (매트 알파에 arg4 삭제 스트레인 (G418 : 매트, his3, ura3, leu2 및 arg4)를 교배에 의해 만들어진 his3, leu2, ura3 및 lys2) 및 meiotic haploids는 tetrad 절개로 얻은되었습니다. 따라서, 제어 변형은 라이신과 아르기닌을위한 auxotroph입니다. 미끼 스트레인은 벡터 pBS1479를 사용하여 PCR - 중재 상동 재조합에 의해 만들어졌다. 따라서, 본 연구에서 사용되는 에피토프 태그 협동 친화 정화 (TAP) 태그 (3)입니다.
- SILAC :
- SILAC 제어 변형은 98% L - 라이신 - 4 ,4,5,5 - D4 (0.03 g / L, 캠브리지 동위 원소)와 98% L - 아르기닌 - 13 C 6 (와 보충 최소한 중퇴 미디어에 자란 0.036 g / L, 캠브리지 동위 원소).
- 미끼 스트레인 정상 원소 아미노산과 함께 정기적으로 다양한 매체 성장했다.
- TAP 정화의 첫 단계 [이 프로토콜은 콜드 스프링 하버 연구소 물론 매뉴얼 (4)에서 적응이다]
** -80 ° C의 냉장고에서 정화, 사전 진정 박격포와 유봉 전날 밤. 또한, -20에서 사전 진정 비커 ° C **
오른쪽 사용 (문화 1 패)을하기 전에이 버퍼를 만들기 :- 25 μl PIC (1 / 2000), 1M DTT 50 μl 30 ML NP - 40 버퍼
- 2백분의 1 PIC, 1M DTT 50 μl와 함께 NP - 40 버퍼 20 ML
- 2천분의 1 PIC와 함께 TEV - C 10 ML 버퍼, 1 M DTT 10 μl
SILAC 및 준비
- 미끼 변형 및 컨트롤의 각 OD 600 = 1.0-1.3을 별도로 부담 1L 성장.
- 500ml Nalgene의 원심 분리기 튜브의 문화를 하거라. 2580X G.의 부하와 펠릿 세포의 균형
- 50ml 원심 튜브에 세포를 전송하는 동안 차가운 DH 2 O의 50ml로 가만히 따르다 미디어 resuspend 펠릿. 펠렛 세포. ** 당신은 -80에서 펠렛을 멈추게 할 수도 ° C **
- ** 중요 ** 건조 펠렛 중량에 의해 1시 1분에서 미끼의 변형 문화 컨트롤 변형 문화를 일치합니다.
- 1 / / 2000 테아제 억제제 칵테일 (PIC)와 NP - 40 버퍼 10ml 각 세포 펠렛을 Resuspend.
- 직접 다른 하나의 튜브를 decanting하여 두 세포 문화를 섞는다.
연마 - 미리 차게 절구에 액체 N 2를 붓고 그것이 완전히 증발 수 있습니다. 원운동에서 박격포에 셀 2 ML을 추가합니다. 세포를 고정하기 위해 몇 가지 액체 N 2를 붓고. 세포가 미세 분말이 될 때까지 세포를 분쇄. 모든 세포가 지상 때까지 과정을 반복합니다. ** 세포 해동을 허용하지 마십시오. 액체 N 2 필요 ** 추가
- 실온에서 얼음처럼 차가운 비커와 해동에 분말을 전송합니다. 가장자리가 해동하기 시작하면, 2백분의 1 PIC와 함께 NP - 40 버퍼 20 ML를 추가합니다.
- 40 ML Nalgene 튜브로 원유의 lysate를 전송합니다. 39,000 xgfor 30 분에 스핀.
- 기다리는 동안, 세파 로스 2B 비즈 (GE) 300 μl을. NP - 40 버퍼 (1 / 2, 000 PIC) 3 번 300 μl의 구슬을 씻으십시오. 그들이 1:1 슬러리에 있도록 300 μl 버퍼에 비즈를 Resuspend.
사전 클리어링 세포 lysate - 새로운 튜브에 뜨는을 전송하고 세파 로스 2B 비즈를 추가합니다. 30 분 추운 방에 회전 플랫폼에 품어.
- 기다리는 동안, IgG 세파 로스 6 구슬 (GE) 300 μl을. NP - 40 버퍼 (1 / 2, 000 PIC) 3 번 300 μl의 구슬을 씻으십시오. 그들이 1:1 슬러리에 있도록 300 _l 버퍼에 비즈를 Resuspend.
- 펠렛 비즈. 새로운 튜브에 뜨는를 전송합니다. ** 서양 나중에 모래 바닥에 대한 세포 lysate의 나누어지는 저장하기 **
IgG 세파 로스 비즈에 바인딩 - 원심 분리기로 세파 로스 2B 비즈를 제거합니다. IgG 비즈를 (이전 1시 1분 슬러리에 준비) 추가합니다. 보다 효율적인 바인딩을위한 두 튜브로 내용을 구분합니다. 2 시간을 위해 추운 방에 회전 플랫폼에 품어.
- 비즈를 스핀 다운. ** 언바운드 파벌의 나누어지는 ** 저장
- 10 ML NP - 40 버퍼 (1 / 2, 000 PIC)와 구슬을 씻으십시오.
- 3 ML TEV - C 버퍼 (1 / 2, 000 PIC)와 구슬을 씻으십시오. ** 구슬 나누어지는을 저장합니다. 이것은 구속력이 **의 효율성을 반영됩니다
TEV 프로 테아제 절단하여 IgG 비즈에서 Eluting - TEV - C의 1ml 버퍼 (1 / 2, 000 PIC와 함께)에 AcTEV 5 μl를 추가합니다. 혼합 후,보다 효율적인 믹싱을위한 두 1.5 ML Eppendorf 튜브에 내용을 별도의. 밤새 추위 방에 회전 플랫폼에 품어.
- 비즈를 스핀 다운하고 신선한 1.5 ML 튜브에 eluate을 전송하기만하면됩니다. TEV - C 버퍼의 추가 0.5 ML로 비즈 와시
- 한 튜브에 elaute을 결합합니다. 당신은 총 eluate 1.5 ML 있어야합니다.** TEV eluate의 나누어지는 ** 저장
Trichloroacetic 산 (TCA) precipatation은 (질량 분석계 기반 분석을 위해, 우리는 EtOH / 아세트산 석출를 사용하는 것이 좋습니다) - 백퍼센트 TCA와 TCA 25 % aliquots를 조정합니다. 이렇게하려면 750 μl 각 2 튜브에 1.5 ML의 eluate를 구분한다. 튜브에 TCA 100 % 250 μl를 추가합니다. 귀하의 솔루션은 밀키 설정해야합니다.
- 정기 vortexing 30 분 얼음에 놓습니다.
- 30 분 추위 방에 테이블 상단 원심 분리기의 최대 속도로 회전.
- 최대 속도 (추운 방)에서 5 분 0.05 N HCL와 스핀이 들어있는 얼음처럼 차가운 아세톤 500 μl와 함께 한 번 씻으십시오.
- 최대 (추운 방)에서 5 분 얼음처럼 차가운 아세톤과 스핀 500 μl와 함께 한 번 씻으십시오.
- 조심스럽게 아세톤 건조 펠렛를 제거합니다.
- 실버 얼룩의 경우, 1X SDS 샘플 버퍼의 50 μl의 펠렛을 resuspend.
EtOH / 아세테이트 precipatation - 글리코겐 20 μg 추가
- 100 % EtOH로 5 배 희석하고 샘플을 2.5 M 재고, 산도 5.0 50 MM NaCH 3 COO로 조정
- 2 시간에 대한 솔루션을 스탠드
- 펠렛은 실온에서 12,000 X g에서 10 분 원심 분리하여 단백질을 시켰던.
NP - 40 버퍼 (200 ML에 대한)
| 주식 농도 | 추가 | |
| 10 MM 나트륨 인산 버퍼 (산도 7.2) | 0.1 M | 20 ML |
| 150 MM NaCl | 2 M | 15 ML |
| 1퍼센트 NP - 40 | 백퍼센트 | 2 ML |
| 50 MM NaF | 1 M | 10 ML |
| 0.1 MM 나 세 할머니 4 | 10 MM | 2 ML |
| 200 ML에 볼륨 | ||
사용하기 전에 ADD :
- 1 M DTT 1 / 1, 000
- PIC의 1 / 2, 000 (프로 테아제 억제제 칵테일)
TEV - C 버퍼 (50 ML 용)
| 주식 농도 | 추가 | |
| 25 MM 트리스 (산도 8.0) | 100 MM | 12.5 ML |
| 150 MM NaCl | 2 M | 3.75 ML |
| 0.1 % NP - 40 | 백퍼센트 | 50 _l |
| 0.5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | 500 MM | 50 __l |
| 50 ML에 볼륨 | ||
사용하기 전에 ADD :
- 1분의 1, 1M DTT의 000
- PIC 1 / 2, 000
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Discussion
정화 절차를 수행하는 동안 저장된 aliquots (1) 사전 허가 세포 lysate, (2) 바운드 분수 (3) 언바운드 분율, 그리고 (4) eluted 소수를 포함해야합니다. 우리는 실험의 바인딩과 eluting 효율성을 반영하기 위해 안티 - TAP 항체 또는 실버 얼룩을 사용하여 모래 바닥 서양하여 위의 aliquots의 단백질 내용을 분석하는 것이 좋습니다. 은색 스테인드 젤과 얼룩의 예는 그림 1에 표시됩니다.
SILAC은 단백질 바인딩 파트너 편견과 계량 측정으로 우리를 제공하고 있기 때문에, 우리는 샘플 손실을 최소화하기 위해 TAP 정화의 첫 단계를 않습니다. 당신이 unspecific 바인딩의 상당한 양의가 발생하면, 당신은 콜드 스프링 하버 매뉴얼 (4)에서 찾을 수있는 전체 프로토콜을 수행하실 수 있습니다.
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References
- Loewen, C. J. Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization. Jour. Cell Biol. 179, 467-483 Forthcoming.
- Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics. Methods. 29, 124-130 Forthcoming.
- Puig, O. The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 Forthcoming.
- Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N.
