Summary
Burada Saccharomyces cerevisiae protein kompleksleri tanımlamak için yeni bir nicel proteomik tekniği açıklar. Bu çalışmada, yüksek özgüllük ile bir ER protein, Scs2p bağlayıcı ortakları tanımlamak için tandem kütle spektrometresi tarafından takip yakınlık arıtma ile birlikte SILAC yöntemi kullandık.
Abstract
Lipidler önemli hücre içi sinyal molekülleri olarak, son zamanlarda engel olarak ve hücre zarının bu işlev, hücresel süreçlerin compartmentalization içinde yapı taşları ve. Ancak, proteinlerin aksine, lipidler, küçük hidrofobik moleküllerdir öncelikle membran iletişim siteleri (MCSS) meydana varsayımla kötü açıklanan nonvesicular yolları, trafik. MCSS endoplazmik retikulum (ER) bir ortaklık organel, örneğin, plazma zarı (PM) ile doğrudan fiziksel temas yapan bölgelerdir. Bu lipid sentezini bu sitelere ve MCSS lipid trafiği için önemli olduğunu ima, lipid sentezleme enzimleri, ER-PM MCSS ER bölümü zenginleştirilmiştir. Maya 1000'den fazla hücre başına kişiler ve tüm ökaryotlarda korunmuş doğa, bolluk nedeniyle ER-PM MCSS çalışma için ideal bir model. MCSS oluşturan proteinler ortaya çıkararak hücrelerindeki lipidler trafik nasıl yapılır anlamak için önemlidir, ve sinyal molekülleri olarak hareket. Biz Scs2p denilen bir ER ER-PM MCSS lokalize bulundu ve kendi oluşumu için önemlidir. Biz Scs2p moleküler ortaklarının ortaya çıkarılması üzerinde duruldu. Protein kompleksleri tanımlanması geleneksel olarak ilk kez kütle spektrometresi tarafından peptidlerin protein bantları ve analiz jel sindirim jel elektroforez, saflaştırılmış protein örnekleri çözme dayanır. Bu genellikle proteinlerin küçük bir alt çalışma sınırlar. Ayrıca, protein kompleksleri işlem sırasında denatüre veya fizyolojik olmayan koşullara maruz kalmaktadır. Bu sorunları aşmak için, tarafsız ve nicel veri ayıklamak için büyük ölçekli nicel proteomik tekniği uyguladık. Biz, bir etiketsiz kontrol suşu proteinlerin zımba izotop çekirdekleri dahil hücre kültürü amino asitleri (SILAC) ile stabil izotop etiketleme kullanın. Eşit hacimli, etiketli, kültür ve etiketsiz, SILAC etiketli kültürü birbirine karıştırılır ve sıvı nitrojen içinde taşlama tarafından parçalanmış. Daha sonra protein kompleksleri aşağı çekmek için bir yakınlık arıtma işlemi yürütmek. Sonuç olarak, yüksek performanslı sıvı kromatografisi / tandem kütle spektrometresi ile analiz için hazır protein örnek, hızlandırabilir. En önemlisi, kontrol suşu proteinler ağır izotop etiketli ve etiketsiz proteinlere karşı yem zorlanma sayılabilir edilebilir bir kütle / yük değişimi üretecek. Bu nedenle, kirleticiler, ya da belirsiz bağlama kolayca ortadan kaldırılabilir. Bu yaklaşımı kullanarak, ER-PM MCSS lokalize birkaç roman proteinleri tespit ettik. Burada bizim yaklaşımımız ayrıntılı bir açıklama mevcut.
Protocol
Gereç ve Yöntem
- Maya suşları
- Bu çalışmada kullanılan tüm suşlar BY4742 arka plan üzerine dayanır. Arg4 silme suşu (G418: Mat, his3, ura3, leu2 ve Arg4): BY4742 (Mat alfa, çiftleşme SILAC kontrol suşu (Mat, his3, leu2, ura3, lys2 ve Arg4: G418) tarafından yapıldı his3, leu2, ura3 ve lys2) ve mayotik haploids tetrad diseksiyonu ile elde edilmiştir. Bu nedenle, kontrol suşu, lisin ve arjinin bir auxotroph. Yem gerilme vektörü pBS1479 kullanarak PCR-aracılı homolog rekombinasyon tarafından yapılmıştır. Bu nedenle, bu çalışmada kullanılan epitopu etiketi tandem yakınlık arıtma (TAP) etiketi (3).
- SILAC:
- SILAC kontrol suşu% 98 L-lizin-4 ,4,5,5-D4 (0.03 g / L, Cambridge İzotop) ve% 98 L-arjinin-13 C 6 (desteklenen minimum ayrılma medya yetişen 0.036 g / L, Cambridge İzotop).
- Yem zorlanma normal izotopik amino asitler düzenli zengin bir ortamda yetişmiştir.
- İlk aşama TAP arıtma [Bu protokol Cold Spring Harbor laboratuvar elbette manuel (4) uyarlanmıştır]
** Önceki gece -80 ° C derin dondurucu arıtma, ön-chill havanda. Ayrıca, bir beher öncesi chill -20 ° C **
(1 L kültür) hemen önce bu tamponlar olun:- 25 ul PIC (1 / 2000), 1M DTT 50 ul ile 30 ml NP-40 tampon
- NP-40, 1 / 200, PIC 1M DTT 50 ul ile tampon 20 ml
- TEV-C 10 ml, 1 / 2000 PIC ile tampon, 1 M DTT 10 ul
SILAC ve sınava hazırlık
- Yem zorlanma ve kontrolü her OD 600 = 1,0-1,3 için ayrı ayrı zorlanma 1L büyütün.
- 500ml Nalgene santrifüj tüplerine kültür dökün. 2580X g. yük ve pelet hücreleri Dengesi
- 50ml santrifüj tüplerine hücreleri aktarımı yaparken soğuk dH 2 O 50ml ile Durusu medya ve tekrar süspansiyon pelet. Pelet hücreleri. ** -80 Pelet dondurabilirsiniz ° C **
- ** Önemli **, kuru pelet ağırlığı ile 1:1 yem gerginlik kültür kontrol suşu kültür maç.
- 1 / / 2.000 Proteaz İnhibitör Kokteyl (PIC) ile tampon NP-40 10ml her hücre pelletini tekrar.
- Diğer bir tüp doğrudan şişeden iki hücre kültürleri karıştırın.
Öğütme - Önceden soğutulmuş harç içine sıvı N 2 dökün ve tamamen buharlaşması için izin verir . Dairesel hareketlerle harç hücre 2 ml ekleyin. Bazı sıvı N 2 hücreleri dondurma dökün. Hücreler, hücreler ince bir toz haline gelinceye kadar eziyet. Tüm hücreleri zemin kadar işlemi tekrarlayın. ** Hücrelerin Çözülme izin vermeyin. Sıvı N 2 Gerekli **
- Oda sıcaklığında, buz gibi soğuk beher ve çözülme toz aktarın. Kenarları Çözülme başladığınızda, 1 / 200 PIC ile NP-40 tampon 20 ml ekleyin.
- 40 ml Nalgene tüpler ham lizat aktarın. 39000 xgfor 30 dakika Spin.
- Beklerken, sepharose 2B boncuk (GE) 300 ul alır. NP-40 tampon (1 / 2, 000 PIC) 3 kez 300 ul boncuk yıkayın. 01:01 bulamaç böylece 300 ul tampon boncuk tekrar
Ön temizleme hücre lizat - Süpernatantı transferi ve yeni bir tüp sepharose 2B boncuk eklemek. 30 dakika süreyle soğuk oda dönen bir platform üzerinde inkübe edin.
- Beklerken, IgG sepharose 6 boncuk (GE) 300 ul alır. NP-40 tampon (1 / 2, 000 PIC) 3 kez 300 ul boncuk yıkayın. 01:01 bulamaç böylece 300 _L tampon boncuk tekrar
- Pelet boncuk. Yeni bir tüp süpernatantı aktarın. ** Batı sonra Blot için bir kısım hücre lizat kaydedin **
IgG sepharose boncuklar için bağlayıcı - Santrifüj sepharose 2B boncuk çıkarın. IgG boncuk (1:01 bulamaç önceden hazırlanmış) ekleyin. Daha verimli bir bağlama için iki tüp içine içeriğini ayırın. 2 saat süreyle soğuk oda dönen bir platform üzerinde inkübe edin.
- Boncuk aşağı spin. ** Ilişkisiz hizip bir kısım ** Kaydet
- 10 ml NP-40 tamponu (1 / 2, 000 PIC) ile yıkayın boncuk.
- Boncuk 3 ml TEV-C tampon (1 / 2, 000 PIC) ile yıkayın. ** Boncuklar bir kısım kaydedin. Bu bağlayıcı ** verimliliği yansıtacak
TEV proteaz bölünme IgG boncuk salınımlı - TEV-C 1 ml tampon (1 / 2, 000 PIC) için 5 ul AcTEV ekleyin. Karıştırıldıktan sonra, daha etkin bir şekilde karıştırılması için iki adet 1.5 ml Eppendorf tüpleri içine içeriğini ayrı. Gece soğuk oda dönen bir platform üzerinde inkübe edin.
- Boncuklar Spin ve 1.5 ml taze bir tüp eluat transfer. TEV-C tampon ek 0.5 ml boncuk yıkayın
- Bir tüp elaute birleştirin. Eluat, toplam 1.5 ml olmalıdır.** TEV eluat bir kısım ** Kaydet
Trikloroasetik asit (TCA) precipatation (kütle spektrometresi tabanlı analiz için, biz EtOH / asetat yağış kullanmanızı tavsiye ederiz) - % 25% 100 TCA TCA alikotları ayarlayın. Bunu yapmak için, her biri 750 ul 2 tüp içine 1.5 ml eluat ayırın. Tüp TCA% 100 250 ul ekleyin. Sizin çözüm sütlü açmalısınız.
- Periyodik vorteks ile 30 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin.
- 30 dakika süreyle soğuk oda masa üstü santrifüj maksimum hızda dönerler.
- 500 ul 0.05 N HCl ve spin içeren maksimum hız (soğuk oda) az 5 dakika buz gibi aseton ile bir kez yıkayın.
- Ul 500 max (soğuk oda), 5 dakika buz gibi aseton ve spin ile bir kez yıkayın.
- Aseton ve kuru pelet dikkatlice çıkarın.
- Gümüş boyama, 1X SDS numune tamponu 50 ul pelet tekrar süspansiyon haline getirin.
EtOH / asetat precipatation - 20 mg glikojen ekle
- 5X örnekleri% 100 EtOH ile seyreltilir ve 2.5 M stok, pH 5.0, 50 mM nach 3 COO uyum
- 2saat için çözüm Standı
- Pelet 12.000 X g oda sıcaklığında 10 dakika süreyle santrifüj yoluyla protein hızlandırdı.
Tampon NP-40 (200 ml)
| Stok konsantrasyonu | Eklemek | |
| 10 mM sodyum fosfat tamponu (pH 7,2) | 0,1 M | 20 ml |
| 150 mM NaCl | 2 M | 15 ml |
| % 1 NP-40 | % 100 | 2 ml |
| 50 mM NaF | 1 M | 10 ml |
| 0.1 mM Na 3 VO 4 | 10 mM | 2 ml |
| 200 ml hacim | ||
Kullanmadan önce ADD:
- 1 M DTT 1 / 1, 000
- PIC 1 / 2, 000 (Proteaz İnhibitörleri Kokteyl)
TEV-C Tampon (50 ml)
| Stok konsantrasyonu | Eklemek | |
| 25 mM Tris (pH 8.0) | 100 mM | 12.5 ml |
| 150 mM NaCl | 2 M | 3.75 ml |
| % 0.1 NP-40 | % 100 | 50 _L |
| 0.5 mM EDTA | 500 mm | 50 __l |
| 50 ml hacim | ||
Kullanmadan önce ADD:
- 1 / 1, 000 1M DTT
- PIC 1 / 2, 000
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Arıtma işlemi sırasında kaydedilen alikotları (1) ön-temizlenir hücre lizat, (2) bağlı fraksiyon, (3) bağlanmamış fraksiyonu, ve (4) yıkandı, fraksiyon içermelidir. Biz Batı tarafından yukarıda alikotları protein içeriğini analiz deney bağlayıcı ve salınımlı etkinliğini yansıtmak için anti-TAP antikor veya gümüş boyama kullanarak blot önerilir. Gümüş lekeli bir jel ve leke örnekleri Şekil 1'de gösterilmiştir.
SILAC protein bağlayıcı ortakları, tarafsız ve niceliksel ölçümler bize bu yana, sadece örnek kaybını en aza indirmek için TAP arınma ilk aşaması. Belirsiz bağlama önemli miktarda yaşarsanız, Cold Spring Harbor manuel (4) bulunabilir tüm protokol, yürütmek isteyebilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Loewen, C. J. Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization. Jour. Cell Biol. 179, 467-483 Forthcoming.
- Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics. Methods. 29, 124-130 Forthcoming.
- Puig, O. The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 Forthcoming.
- Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N.
