Summary
Här beskriver vi en ny kvantitativ proteomik teknik för att identifiera proteinkomplex i Saccharomyces cerevisiae. I denna studie har vi använt SILAC metoden tillsammans med affinitet rening följt av tandem masspektrometri för att identifiera sig med hög specificitet bindande partner en ER protein, Scs2p.
Abstract
Lipider är byggstenar i cellmembran som fungerar som barriärer och i uppdelning av cellulära processer, och nyligen, som viktiga intracellulära signalmolekyler. Men till skillnad från proteiner, lipider är små hydrofoba molekyler att trafiken i första hand av dåligt beskrivna nonvesicular rutter, som är en hypotes att ske på platser membran kontakt (MCSS). MCSS är regioner där endoplasmatiska retiklet (ER) gör direkt fysisk kontakt med en partnering organell, t.ex. plasmamembran (PM). ER del av ER-PM MCSS anrikas i lipid-syntetiserande enzymer, vilket tyder på att lipid syntes vänder sig till dessa platser och som innebär att MCSS är viktiga för lipid trafik. Jäst är en idealisk modell för att studera ER-PM MCSS på grund av sitt överflöd, med över 1000 kontakter per cell, och deras bevarade natur i alla eukaryoter. Upptäcka de proteiner som utgör MCSS är avgörande för att förstå hur lipider trafiken sker i cellerna och hur de fungerar som signalmolekyler. Vi har funnit att ett ER kallas Scs2p lokalisera till ER-PM MCSS och är viktig för deras bildande. Vi fokuserar på att avslöja molekylära partners Scs2p. Identifiering av proteinkomplex bygger traditionellt på första lösa renat protein prover med gelelektrofores, följt av i-gel nedbrytning av protein band och analys av peptider med masspektrometri. Detta begränsar ofta studien till en liten delmängd av proteiner. Dessutom är proteinkomplex utsätts för denaturering eller icke-fysiologiska förhållanden under förfarandet. För att kringgå dessa problem har vi genomfört en omfattande kvantitativ proteomik teknik för att utvinna objektiva och kvantifierade uppgifter. Vi använder oss av stabila isotopen märkning med aminosyror i cellkultur (SILAC) för att införliva häfta isotop kärnor i proteiner i en otaggad kontrollisolat. Lika volymer av taggade kultur och omärkta, SILAC-märkt kultur blandas och lyseras av slipning i flytande kväve. Vi genomför sedan en procedur affinitet rening för att dra ner protein komplex. Slutligen fällning vi proteinet provet, som är redo för analys med högpresterande vätskekromatografi / tandem masspektrometri. Viktigast är proteiner i kontrollrummet stam märkt av den tunga isotopen och kommer att producera en massa / laddning förskjutning som kan kvantifieras mot omärkta proteiner i betet stammen. Därför kan föroreningar eller ospecifika bindande lätt elimineras. Genom att använda denna metod har vi identifierat flera nya proteiner som lokaliserar till ER-PM MCSS. Här presenterar vi en detaljerad beskrivning av vårt synsätt.
Protocol
Material och metoder
- Jäststammar
- Alla stammar som används i denna studie är baserade på BY4742 bakgrunden. Den SILAC kontroll stam (Matt en, his3, leu2, ura3, lys2 och Arg4:: G418) gjordes vid parning Arg4 radering stam (Matt en, his3, ura3, leu2 och Arg4:: G418) till BY4742 (Mat alfa, his3, leu2, ura3 och lys2) och meiotiska haploids erhölls genom tetrad dissekering. Därför är kontroll stam en auxotroph för lysin och arginin. Betet stammen gjordes av PCR-medierad homolog rekombination med hjälp av vektorn pBS1479. Därför är epitop tagg som används i denna studie tandem affinitet rening (TAP) tag (3).
- SILAC:
- Den SILAC kontrollisolatets odlades i minimala bortfall media kompletteras med 98% L-lysin-4 ,4,5,5-D4 (0,03 g / L, Cambridge Isotope) och 98% L-arginin-13 C 6 (0,036 g / L, Cambridge Isotope).
- Betet stam odlades i regelbunden rikt medium med normala isotopanalys aminosyror.
- Första etappen av TAP-rening [Detta protokoll är anpassad från Cold Spring Harbor Laboratory naturligtvis manuell (4)]
** Kvällen innan din rening, pre-chill mortel i -80 ° C frys. Även pre-chill en bägare i -20 ° C **
Göra dessa buffertar höger innan användning (för 1 L i kultur):- 30 ml NP-40 buffert med 25 l PIC (1 / 2000), 50 ìl 1M DTT
- 20 ml av NP-40 buffert med 1 / 200 PIC, 50 ìl 1M DTT
- 10 ml TEV-C buffert med 1 / 2000 PIC, 10 l 1 M DTT
SILAC och förberedelse
- Odla 1L varje bete stam och kontrollisolaten separat till OD 600 = 1,0 till 1,3.
- Häll kultur i 500 ml Nalgene centrifugrör. Balansera belastningen och pellets celler vid 2580X g.
- Dekantera media och resuspendera pellets med 50 ml av kallt dH 2 O medan överföra celler till 50 ml centrifugrör. Pellets celler. ** Du kan frysa pellets vid -80 ° C **
- ** Viktigt ** matcha kulturen kontrollisolatets till betet stam kultur i 1:01 av torra pellets vikt.
- Resuspendera varje cell pelleten i 10 ml av NP-40 buffert med en / / 2000 Proteashämmare Cocktail (PIC).
- Blanda de två cellkulturer genom att direkt dekantering en slang till den andra.
Slipning - Häll flytande N 2 i pre-kyld mortel och låt det helt avdunsta. Tillsätt 2 ml av celler till murbruk i cirkelrörelse. Häll lite flytande N 2 att frysa celler. Slipa celler tills cellerna blir fint pulver. Upprepa processen tills alla celler är marken. ** Låt inte cellerna att tina. Tillsätt flytande N 2 vid behov **
- Överför pulvret till en iskall bägare och tina i rumstemperatur. När kanterna börjar tina, tillsätt 20 ml NP-40 buffert med 1 / 200 PIC.
- Överför råa lysat till 40-ml Nalgene rör. Snurra på 39 tusen xgfor 30 min.
- Medan du väntar, ta 300 ìl Sepharose 2B pärlor (GE). Tvätta pärlor i 300 l av NP-40 buffert (1 / 2, 000 PIC) 3 gånger. Resuspendera pärlor i 300 l buffert så att de är i 1:1 flytgödsel.
Pre-clearing cell lysat - Överför supernatanten till ett nytt rör och tillsätt Sepharose 2B pärlor. Inkubera på en roterande plattform i kylrum i 30 min.
- Medan du väntar, ta 300 l av IgG Sepharose 6 pärlor (GE). Tvätta pärlor i 300 l av NP-40 buffert (1 / 2, 000 PIC) 3 gånger. Resuspendera pärlor i 300 _l buffert så att de är i 1:1 flytgödsel.
- Pellets kulorna. Överför supernatanten till ett nytt rör. ** Spara en delmängd av cellen lysat för Western blotting senare **
Bindningen till IgG sepharose pärlor - Ta bort Sepharose 2B pärlor genom centrifugering. Lägg till IgG pärlor (tidigare upprättad 01:01 slurry). Separera innehållet i två tuber för effektivare bindande. Inkubera på en roterande plattform i kylrum i 2 tim.
- Spinn ner kulorna. ** Spara en alikvot av den obundna fraktionen **
- Tvätta pärlor med 10 ml NP-40 buffert (1 / 2, 000 PIC).
- Tvätta pärlor med 3 ml TEV-C buffert (1 / 2, 000 PIC). ** Spara en delmängd av pärlor. Detta avspeglar effektiviteten i bindande **
Eluerande från IgG Pärlor efter TEV proteas klyvning - Tillsätt 5 ìl av AcTEV till 1 ml TEV-C-buffert (med 1 / 2, 000 PIC). Efter blandning separata innehållet i två 1,5 ml Eppendorf-rör för effektivare blandning. Inkubera på en roterande plattform i kylrum över natten.
- Spinn ner pärlorna och överföra all vätska en ny 1,5 ml rör. Tvätta pärlor med ytterligare 0,5 ml TEV-C buffert
- Kombinera elaute i ett rör. Du bör ha 1,5 ml av eluatet totalt.** Spara en delmängd av TEV eluatet **
Triklorättiksyra (TCA) precipatation (För masspektrometri-baserad analys, rekommenderar vi att du använder EtOH / acetat nederbörd) - Justera portioner till 25% TCA med 100% TCA. För att göra detta, separera 1,5 ml eluat i 2 rör med 750 l vardera. Tillsätt 250 l 100% TCA till röret. Din lösning ska vända mjölkig.
- Placera på is i 30 min med periodiska vortexa.
- Spin vid maximal hastighet i bordsskivan centrifug i kylrum i 30 min.
- Tvätta en gång med 500 ìl av iskall aceton innehåller 0,05 N HCl och snurrar i 5 minuter på högsta hastighet (kylrum).
- Tvätta en gång med 500 ìl av iskall aceton och centrifugera i 5 minuter vid max (kylrum).
- Ta försiktigt bort aceton och torr pellets.
- För silverfärgning, suspendera pelleten i 50 l 1X SDS prov buffert.
EtOH / acetat precipatation - Lägg till 20 mikrogram av glykogen
- Späd prover 5X med 100% EtOH och justera till 50 mm nach 3 COO med 2,5 m lager, pH 5,0
- Stå lösningen för 2hr
- Pellets utfällda proteiner genom centrifugering i 10 min vid 12 tusen X g vid rumstemperatur.
NP-40 Buffer (för 200 ml)
| Stock koncentration | Lägg till | |
| 10 mM natriumfosfat buffert (pH 7,2) | 0,1 M | 20 ml |
| 150 mM NaCl | 2 M | 15 ml |
| 1% NP-40 | 100% | 2 ml |
| 50 mM NaF | 1 M | 10 ml |
| 0,1 mM Na 3 VO 4 | 10 mM | 2 ml |
| Volym till 200 ml | ||
ADD före användning:
- 1 / 1, 000 1 M DTT
- 1 / 2, 000 av PIC (proteashämmare Cocktail)
TEV-C Buffer (för 50 ml)
| Stock koncentration | Lägg till | |
| 25 mM Tris (pH 8,0) | 100 mM | 12,5 ml |
| 150 mM NaCl | 2 M | 3,75 ml |
| 0,1% NP-40 | 100% | 50 _l |
| 0,5 mM EDTA | 500 mm | 50 __l |
| Till 50 ml | ||
ADD före användning:
- 1 / 1, 000 1 M DTT
- 1 / 2, 000 av PIC
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den alikvoter sparat under reningen förfarande bör omfatta (1) före rensas cell lysat, (2) bundna fraktionen, (3) obundna fraktionen, och (4) eluerade bråk. Vi rekommenderar att analysera protein innehållet i ovanstående alikvoter av Western blotting med anti-TAP antikropp eller silverfärgning att återspegla den bindande och eluerande effektiviteten i experimentet. Exempel på en silver färgad gel och en blot visas i figur 1.
Sedan SILAC ger oss objektiva och kvantifierade mätningar av proteinbindning partners, vi gör bara det första steget i TAP rening för att minimera prov förlust. Om du upplever betydande mängder av ospecifik bindning, kan du utföra hela protokollet, som finns i Cold Spring Harbor manuell (4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Loewen, C. J. Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization. Jour. Cell Biol. 179, 467-483 Forthcoming.
- Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics. Methods. 29, 124-130 Forthcoming.
- Puig, O. The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 Forthcoming.
- Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N.
