Summary
ここでは、出芽酵母でのタンパク質複合体を識別するための新しい定量的プロテオミクスの手法を説明します。本研究では、我々は、高い特異性でERタンパク質、Scs2pの結合パートナーを同定するためにタンデム質量分析が続くアフィニティー精製と一緒にSILACメソッドを使用している。
Abstract
脂質は細胞膜のビルディングブロックの障壁として及び細胞プロセスの区画で、そして最近では、重要な細胞内シグナル伝達分子として機能です。しかし、タンパク質とは異なり、脂質は主に膜の接触部位（MCSの）で起こると仮定しているが不十分で説明非小胞性の経路によって小さな疎水性分子は、トラフィックです。 MCSのは、小胞体（ER）は提携細胞小器官、例えば、細胞膜（PM）との直接的な物理的接触を行う領域です。 ER - PM MCSのER部分は、その脂質の合成は、これらのサイトにリダイレクトし、MCSのは脂質のトラフィックのために重要であることを意味しているを示唆し、脂質合成酵素に富んでいる。酵母は、1000種類以上の細胞あたりの連絡先、およびすべての真核生物におけるそれらの保存された自然と、ために彼らの豊かなER - PM MCSを研究する理想的なモデルです。 MCSを構成するタンパク質を明らかにする脂質のトラフィックは細胞内でどのように達成されるかを理解する上で重要な、そしてそれらがどのようにシグナル伝達分子として作用です。我々はScs2pと呼ばれるERは、ER - PMのMCSのに局在することを発見し、その形成に重要ですしている。我々はScs2pの分子のパートナーを発掘に重点を置いています。タンパク質複合体の同定は、伝統的に質量分析法によるタンパク質のバンドやペプチドの分析のゲル内消化に続いて、最初にゲル電気泳動によって精製したタンパク質サンプルを解決することに依存しています。これは、しばしばタンパク質の小さなサブセットに調査を制限します。また、タンパク質複合体は、手順の間に変性または非生理的な条件にさらされている。これらの問題を回避するために、我々は公平と定量データを抽出するために大規模な定量的プロテオミクスの手法を実装している。我々は、タグの付いていない対照菌株中のタンパク質にステープル同位体の原子核を組み込むために細胞培養におけるアミノ酸（SILAC）と安定同位体標識法を使用してください。タグ付けされた文化とタグなし、SILAC標識文化の等量を混合し、液体窒素中で粉砕することにより溶解されています。私たちは、その後、タンパク質複合体をプルダウンするアフィニティー精製の手順を実行します。最後に、我々は、高速液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析法による分析のための準備ができているタンパク質試料を、沈殿させる。最も重要なことは、対照株のタンパク質は、重い同位体で標識し、餌の株では非標識蛋白質に対する定量することができる質量/電荷シフトを生成します。したがって、汚染物質、または非特異的な結合を容易に除去することができます。このアプローチを使用することによって、我々は、ER - PMのMCSのためにローカライズするいくつかの新規タンパク質を同定した。ここでは、我々のアプローチの詳細な説明を提示する。
Protocol
材料と方法
- 酵母菌株
- 本研究で使用したすべての菌株はBY4742背景に基づいています。 SILACのコントロール株（ マット、HIS3、LEU2、URA3、LYS2とarg4に：：G418は）：BY4742（マットアルファ、にarg4に欠失株（G418：マット、HIS3、URA3、LEU2、arg4は対象を ）交配することにより行われたHIS3、LEU2、URA3とLYS2）、および減数分裂半数体は四分子解剖によって得られた。したがって、対照株では、リジンおよびアルギニンのための栄養要求株である。餌のひずみは、ベクトルpBS1479を用いてPCRを介した相同組換えによって作られた。したがって、本研究で使用したエピトープタグは、タンデムアフィニティー精製（TAP）タグ（3）です。
- SILAC：
- SILACの対照株は98％、L -リジン- 4 ,4,5,5 - D4（0.03 g / Lの、ケンブリッジアイソトープ）と98％L -アルギニン- 13 C 6（0.036グラム/を添加した最小のドロップアウトの培地で培養したL、ケンブリッジアイソトープ）。
- 餌の株は、通常の同位体アミノ酸との定期的な富栄養培地で増殖させた。
- TAPの精製の最初の段階で[このプロトコルは、コールドスプリングハーバー研究所コースマニュアル（4）から改作したものです]
** -80 ° Cの冷凍庫でお使い精製、プレチル乳鉢と乳棒の前夜。また、-20プレチルビーカー° C **
右使用前にこれらのバッファを作る（培養液1 Lの場合）：- 25μlのPIC（1 / 2000）、1M DTTを50μlと30ミリリットルNP - 40バッファー
- 200分の1 PIC、1M DTT50μlのとNP - 40バッファー20 mlの
- 2000分の1 PIC、1 M DTTを10μlとTEV - Cの緩衝液10ml
SILACと準備
- OD 600 = 1.0から1.3に別々に餌株と対照株の各1L成長する。
- 500ミリリットルNalgeneの遠心管に文化を注ぐ。 2580X gで負荷し、細胞をペレット化のバランスをとる
- 50ミリリットルの遠心チューブに細胞を転送中に風邪のdH 2 O 50mlのあるデカントメディアとペレットを再懸濁します。細胞をペレット化。 **あなたは、-80 ° C **をペレットを凍結することができる
- **重要**乾燥ペレットの重量で1:1の餌のひずみ文化にコントロール株の文化と一致している。
- 1 / / 2,000プロテアーゼインヒビターカクテル（PIC）とNP - 40バッファー10mlの中の各細胞ペレットを再懸濁します。
- 直接、片方の管をデカントして、2つの培養細胞を混ぜる。
研削 - あらかじめ冷却した乳鉢に液体窒素を注ぎ、それが完全に蒸発させることができます。円を描くように乳鉢に細胞の2 mlを加え。細胞を凍結するいくつかの液体N 2を注ぐ。細胞は微粉末になるまで細胞を挽く。すべての細胞が地面になるまでプロセスを繰り返します。 **細胞が融解しないようにしてください。液体N 2に必要な**を追加
- 室温で氷冷ビーカーと融解する粉末を転送する。エッジが解凍し始めるときは1 / 200 PICとNP - 40緩衝液20 mlを加える。
- 40ミリリットルNalgene管に粗ライセートを転送する。 39000 xgfor 30分で回転する。
- 待っている間、セファロース2Bビーズ（GE）の300μlを取る。 NP - 40バッファー（1 / 2、000 PIC）の3倍の300μlでビーズを洗浄する。彼らは1:1のスラリーになるように300μlのバッファーでビーズを再懸濁します。
前洗浄細胞ライセート - 上清を新しいチューブに移し、セファロース2Bのビーズを追加。 30分間の低温室内の回転台にインキュベートする。
- 待っている間、IgGセファロース6ビーズ（GE）の300μlを取る。 NP - 40バッファー（1 / 2、000 PIC）の3倍の300μlでビーズを洗浄する。彼らは1:1のスラリーになるように300 _lバッファーでビーズを再懸濁します。
- ペレットビーズ。上清を新しいチューブに移す。 **ウェスタンブロッティング後のために細胞溶解液のアリコートを保存する**
IgG抗体セファロースビーズに結合する - 遠心分離によってセファロース2Bのビーズを削除します。 IgG抗体ビーズを（以前に午前1時01スラリーに調製）を追加します。より効率的な結合のための2つのチューブに内容を区切ります。 2時間低温室での回転台にインキュベートする。
- ビーズをスピンダウンします。 **バインドされていない派閥のアリコートを保存する**
- 10ミリリットルNP - 40バッファー（1 / 2、000 PIC）でビーズを洗浄する。
- 3ミリリットルTEV - Cバッファー（1 / 2、000 PIC）でビーズを洗浄する。 **ビーズのアリコートを保存します。これは、バインディング**の効率性を反映します
TEVプロテアーゼ切断により、IgG抗体のビーズから溶出 - TEV - C 1mlの緩衝液（1 / 2、000 PICと）にAcTEVの5μlを添加する。混合した後、より効率的な混合するための2つの1.5mlのエッペンドルフチューブに内容を区切ってください。一晩低温室での回転台にインキュベートする。
- ビーズの回転を停止し、新しい1.5 mlチューブに溶出液を移す。 TEV - Cバッファーの追加の0.5mlでビーズを洗浄
- 1本のチューブにelauteを組み合わせる。あなたは合計で溶出液の1.5 mlを持つ必要があります。** TEV溶出液のアリコートを保存する**
トリクロロ酢酸（TCA）precipatationは、（質量分析ベースの分析では、我々は、エタノール/酢酸沈殿法を使用することをお勧めします） - 100％TCAとTCAを25％にアリコートを調整します。これを行うには、750μlの各2試験管に1.5 mlの溶出液を分離する。チューブのTCA 100％の250μlを追加します。ソリューションは、乳白色にする必要があります。
- 周期的にボルテックスしながら30分間氷上に置きます。
- 30分間低温室でのテーブルトップ遠心機の最高速度でスピン。
- 最大速度（低温室）で5分間0.05 N HClおよびスピンを含む氷冷アセトンを500μlで1回洗浄します。
- 最大（低温室）で5分間氷冷アセトンとスピンの500μlので1回洗浄します。
- 慎重にアセトンとドライペレットを取り外します。
- 銀染色の場合は、1 × SDSサンプルバッファー50μlでペレットを再懸濁します。
エタノール/酢酸precipatation - グリコーゲンの20μgを追加する
- 100％EtOHで5倍のサンプルを希釈し、2.5 M在庫切れと50mMのNaCH 3 COO、pHを5.0に調整する
- 2時間のためのソリューションをスタンド
- ペレットは、室温で12,000 × gで10分間の遠心分離によってタンパク質を沈殿させた。
NP - 40バッファー（200 mlの）
| ストック濃度 | 追加 | |
| 10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2） | 0.1 M | 20ミリリットル |
| 150mMのNaCl | 2 M | 15ミリリットル |
| 1％NP - 40 | 100パーセント | 2ミリリットル |
| 50mMのNaFを | 1 M | 10ミリリットル |
| 0.1mMののNa 3 VO 4 | 10 mMの | 2ミリリットル |
| 200mlにボリューム | ||
使用前にADD：
- 1 M DTTの1 / 1、000
- PICの1 / 2、000（プロテアーゼ阻害剤のカクテル）
TEV - Cバッファー（50 mlの）
| ストック濃度 | 追加 | |
| 25mMトリス（pH8.0）に | 100mMの | 12.5ミリリットル |
| 150mMのNaCl | 2 M | 3.75ミリリットル |
| 0.1％NP - 40 | 100パーセント | _l 50 |
| 0.5mMのEDTA | 500mMの | __l 50 |
| 50mlに容積 | ||
使用前にADD：
- 1M DTTの1 / 1、000
- PICの1 / 2、000
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Discussion
精製処理中に保存さアリコートは、（1）事前に清澄化細胞ライセート、（2）結合画分、（3）非結合画分、および（4）溶出画分を含める必要があります。我々は、実験の結合と溶出効率を反映するために抗TAP抗体または銀染色を用いてウェスタンブロッティングにより上記アリコートの濃度のタンパク質を分析することをお勧めします。銀染色したゲルとブロットの例を図1に示されています。
SILACは、タンパク質結合パートナーの公平と定量測定を提供してくれますので、我々はサンプルの損失を最小限に抑えるために、TAPの精製の第一段階を行います。非特異的な結合を大量に発生した場合には、コールドスプリングハーバーマニュアル（4）で見つけることができるプロトコル全体を、実行したい場合があります。
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References
- Loewen, C. J. Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization. Jour. Cell Biol. 179, 467-483 Forthcoming.
- Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics. Methods. 29, 124-130 Forthcoming.
- Puig, O. The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 Forthcoming.
- Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N.
