Summary
Ici, nous décrivons une nouvelle technique quantitative en protéomique pour identifier les complexes protéiques chez Saccharomyces cerevisiae. Dans cette étude, nous avons utilisé la méthode SILAC avec purification par affinité suivie par spectrométrie de masse en tandem afin d'identifier avec une grande spécificité les partenaires de liaison d'une protéine ER, Scs2p.
Abstract
Les lipides sont les constituants des membranes cellulaires qui fonctionnent comme des barrières et dans le cloisonnement des processus cellulaires, et récemment, aussi importantes molécules de signalisation intracellulaire. Cependant, contrairement aux protéines, les lipides sont des petites molécules hydrophobes que le trafic principalement par les routes mal décrits nonvesicular, qui sont supposé se produire à des sites de contact à membrane (MCS). MCS sont des régions où le réticulum endoplasmique (RE) fait un contact physique direct avec un partenariat organite, par exemple, la membrane plasmique (MP). La portion des ER ER-PM MCS est enrichi en lipides synthétiser des enzymes, ce qui suggère que la synthèse des lipides est dirigé vers ces sites et ce qui implique que MCS sont importantes pour le trafic des lipides. La levure est un modèle idéal pour étudier ER-PM PMRs raison de leur abondance, avec plus de 1000 contacts par cellule, et leur nature préservée chez tous les eucaryotes. Découvrir des protéines qui constituent MCS est essentielle pour comprendre comment le trafic des lipides est accompli dans les cellules, et comment ils agissent comme des molécules de signalisation. Nous avons trouvé que l'ER appelé Scs2p localiser à ER-PM MSSC et est important pour leur formation. Nous nous concentrons sur la découverte des partenaires moléculaires de la Scs2p. Identification des complexes protéiques repose traditionnellement sur la première résolution échantillons protéine purifiée par électrophorèse sur gel, suivie par la digestion dans le gel des bandes de protéines et d'analyse des peptides par spectrométrie de masse. Cette limite souvent l'étude d'un petit nombre de protéines. En outre, les complexes protéiques sont exposés à la dénaturation ou non des conditions physiologiques lors de la procédure. Pour contourner ces problèmes, nous avons mis en œuvre à grande échelle en protéomique technique quantitative d'extraire des données impartiales et quantifiés. Nous utilisons l'étiquetage des isotopes stables avec les acides aminés en culture cellulaire (SILAC) à intégrer des noyaux d'isotopes de base en protéines dans une souche témoin non balisé. Des volumes égaux de la culture marqués et non marqués, la culture SILAC marqués sont mélangés et lysées par broyage dans l'azote liquide. Nous avons ensuite effectuer une procédure de purification par affinité pour abattre des complexes protéiques. Enfin, nous précipiter l'échantillon de protéine, qui est prêt pour l'analyse par chromatographie liquide à haute performance / spectrométrie de masse en tandem. Surtout, les protéines de la souche de contrôle sont marquées par l'isotope lourd et va produire un changement de masse / charge qui peut être quantifiée contre les protéines non marqué dans la souche d'appât. Par conséquent, les contaminants, ou une liaison non spécifique peut être facilement éliminé. En utilisant cette approche, nous avons identifié de nouvelles protéines de plusieurs qui localisent à l'ER-PM MCS. Nous présentons ici une description détaillée de notre approche.
Protocol
Matériel et méthodes
- Les souches de levures
- Toutes les souches utilisées dans cette étude sont basées sur le fond BY4742. La souche de contrôle SILAC (Mat A, his3, leu2, ura3, lys2 et arg4:: G418) a été faite par l'accouplement arg4 souche suppression (Mat A, his3, ura3, leu2, et arg4:: G418) pour BY4742 (Mat alpha, his3, leu2, ura3 et lys2), et les haploïdes méiotique ont été obtenus par dissection tétrade. Par conséquent, la souche de contrôle est un auxotrophe pour la lysine et l'arginine. La souche d'appât a été faite par PCR médiée par recombinaison homologue en utilisant le vecteur pBS1479. Par conséquent, la balise épitope utilisé dans cette étude est la purification par affinité en tandem (TAP) tag (3).
- SILAC:
- La souche de contrôle SILAC été cultivées dans des milieux d'abandon minimum complété avec 98% de L-lysine-4 ,4,5,5-D4 (0,03 g / L, Cambridge Isotope) et 98% de L-arginine-13 C 6 (0,036 g / L, Cambridge Isotope).
- La souche d'appât a été cultivé en milieu riche régulier avec normale isotopique des acides aminés.
- Première étape de la purification TAP [Ce protocole est adapté de la Cold Spring Harbor Laboratory Manual sûr (4)]
** La nuit avant votre purification, de pré-refroidir mortier et un pilon en -80 ° C au congélateur. En outre, de pré-refroidir un bécher de -20 ° C **
Faire ces tampons juste avant utilisation (pour 1 L de culture):- 30 ml de tampon NP-40 avec 25 ul PIC (1 / 2000), 50 pl de 1M TNT
- 20 ml de NP-40 tampon avec 1 / 200 PIC, 50 pi de 1M TNT
- 10 ml de VET-C tampon avec 1 / 2000 PIC, 10 pi de 1 M de DTT
SILAC et la préparation
- Cultivez 1L chacun de la souche appât et le contrôle souche séparément à DO600 = 1,0 à 1,3.
- Verser la culture dans des tubes à centrifuger Nalgene 500ml. Équilibrer la charge et les cellules de bouletage à 2580X g.
- Décanter les médias et resuspendre culot avec 50 ml de froid O DH 2 tout en transférant les cellules pour des tubes à centrifuger 50ml. Cellules Pellet. ** Vous pouvez congeler la pastille à -80 ° C **
- ** IMPORTANT ** match de la culture souche témoin à la culture souche appât dans 1:1 en granulés poids sec.
- Resuspendre chaque cellule dans 10ml boulette de NP-40 tampon avec cocktail Inhibiteur de la protéase 1 / / 2000 (PIC).
- Mélanger les deux cultures cellulaires par décantation directement un tube à l'autre.
Meulage - Verser le liquide de N 2 dans le mortier pré-réfrigérée et lui permettre de s'évaporer complètement. Ajouter 2 ml de cellules au mortier dans le mouvement circulaire. Verser un peu de liquide de N 2 à geler les cellules. Broyer les cellules jusqu'à ce que les cellules deviennent une poudre fine. Répétez le processus jusqu'à ce que toutes les cellules sont broyées. ** Ne pas permettre aux cellules de dégel. Ajouter le liquide de N 2 si nécessaire **
- Transférer la poudre à un bécher glacée et décongeler à température ambiante. Lorsque les bords commencent à dégeler, ajouter 20 ml de NP-40 tampon avec 1 / 200 PIC.
- Transfert lysat brut à 40 ml tubes Nalgene. Centrifuger à 39000 xgfor 30 min.
- En attendant, prenez 300 ul de billes de Sépharose 2B (GE). Laver les billes dans 300 ul de tampon NP-40 (1 / 2, 000 PIC) 3 fois. Resuspendre les perles dans 300 pi de tampon de sorte qu'ils sont en suspension à 01h01.
Lysat cellulaire pré-compensation - Transférer le surnageant dans un nouveau tube et ajouter les perles 2B Sépharose. Incuber sur une plateforme rotative dans une chambre froide pendant 30 min.
- En attendant, prenez 300 pl d'IgG Sépharose 6 perles (GE). Laver les billes dans 300 ul de tampon NP-40 (1 / 2, 000 PIC) 3 fois. Resuspendre les billes en mémoire tampon 300 _l de sorte qu'ils sont en suspension à 01h01.
- Pellet les perles. Transférer le surnageant dans un nouveau tube. ** Enregistrer une aliquote du lysat cellulaire pour Western Blot tard **
La liaison aux IgG billes de sépharose - Retirer les billes de Sépharose 2B par centrifugation. Ajouter les perles d'IgG (préalablement préparé en 1:1 lisier). Séparez le contenu dans deux tubes de liaison plus efficace. Incuber sur une plateforme rotative dans une chambre froide pendant 2 heures.
- Isoler les perles. ** Enregistrer une aliquote de la faction non liée **
- Lavez perles avec 10 ml de tampon NP-40 (1 / 2, 000 PIC).
- Lavez perles avec 3 ml VET-tampon C (1 / 2, 000 PIC). ** Enregistrer une aliquote des billes. Ceci reflète l'efficacité de l'** contraignante
Élution à partir de perles d'IgG par clivage de la protéase TEV - Ajouter 5 ul d'AcTEV à 1ml de la VET-tampon C (avec 1 / 2, 000 PIC). Après mélange, séparer le contenu en deux tubes Eppendorf de 1,5 ml pour un mélange plus efficace. Incuber sur une plateforme rotative dans une chambre froide pendant la nuit.
- Isoler les perles et le transfert de l'éluat dans un nouveau tube de 1,5 ml. Laver les billes avec additionnels de 0,5 ml de tampon C-VET
- Combinez les elaute dans un tube. Vous devriez avoir 1,5 ml d'éluat au total.** Enregistrer une aliquote de l'éluat VET **
Acide trichloracétique (TCA) précipitations sur (Pour une analyse par spectrométrie de masse à base, nous recommandons d'utiliser EtOH / précipitation d'acétate) - Ajustez aliquotes de 25% à 100% de TCA TCA. Pour ce faire, séparer l'éluat 1,5 ml dans 2 tubes de 750 ul chacun. Ajouter 250 pi de 100% de TCA dans le tube. Votre solution doit tourner laiteux.
- Placez-le sur la glace pendant 30 min avec vortex périodiques.
- Centrifuger à vitesse maximale dans la centrifugeuse de table dans une chambre froide pendant 30 min.
- Laver une fois avec 500 pi d'acétone glacée contenant 0,05 N HCl et de spin pendant 5 min à vitesse maximale (chambre froide).
- Laver une fois avec 500 pi d'acétone glacée et de spin pendant 5 min à max (chambre froide).
- Retirer délicatement l'acétone et culot sec.
- Pour coloration à l'argent, resuspendre le culot dans 50 ul de tampon 1X échantillon de SDS.
Précipitations sur EtOH / acétate - Ajouter 20 g de glycogène
- Diluer les échantillons 5X avec EtOH 100% et ajuster à 50 mM NACH 3 COO avec un stock de 2,5 M, pH 5,0
- Placez la solution pour 2h
- Pellet précipité de protéines par centrifugation pendant 10 min à 12000 xg à température ambiante.
NP-40 tampon (pour 200 ml)
| Concentration de stock | Ajouter | |
| 10 mM de tampon phosphate de sodium (pH 7,2) | 0,1 M | 20 ml |
| 150 mM de NaCl | 2 M | 15 ml |
| 1% NP-40 | 100% | 2 ml |
| 50 mM NaF | 1 M | 10 ml |
| 0,1 mM Na 3 VO 4 | 10 mM | 2 ml |
| Volume à 200 ml | ||
Ajouter avant utilisation:
- 1 / 1, 000 de 1 M de DTT
- 1 / 2, 000 du PIC (inhibiteurs de protéase Cocktail)
VET-C Tampon (pour 50 ml)
| Concentration de stock | Ajouter | |
| Tris 25 mM (pH 8,0) | 100 mM | 12,5 ml |
| 150 mM de NaCl | 2 M | 3,75 ml |
| 0,1% de NP-40 | 100% | 50 _l |
| EDTA 0,5 mM | 500 mM | 50 __l |
| Volume à 50 ml | ||
Ajouter avant utilisation:
- 1 / 1, 000 de 1 million de TNT
- 1 / 2, 000 du PIC
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Discussion
Les aliquotes enregistrées au cours de la procédure de purification doit inclure (1) lysat de cellules pré-autorisé, (2) fraction liée, fraction libre (3), et (4) fraction éluée. Nous vous recommandons d'analyser les teneurs en protéines des aliquotes ci-dessus par Western blot utilisant des anticorps anti-anticorps ou TAP coloration à l'argent afin de refléter l'efficacité de fixation et d'élution de l'expérience. Exemples d'un gel coloré à l'argent et une tache sont présentés dans la figure 1.
Depuis SILAC nous fournit des mesures impartiales et quantifiée des partenaires de liaison aux protéines, nous ne faisons que la première étape de la purification TAP pour minimiser la perte d'échantillon. Si vous rencontrez des quantités importantes de liaison non spécifique, vous pouvez mener à bien l'ensemble du protocole, qui peut être trouvé dans le froid manuel Spring Harbor (4).
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References
- Loewen, C. J. Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization. Jour. Cell Biol. 179, 467-483 Forthcoming.
- Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics. Methods. 29, 124-130 Forthcoming.
- Puig, O. The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 Forthcoming.
- Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N.
