Summary
جبل بأكمله في الموقع التهجين هي واحدة من أكثر التقنيات المستخدمة على نطاق واسع في البيولوجيا التطورية. هنا ، نقدم قرار عالية الفلورسنت مزدوجة في البروتوكول الموقع التهجين لتحليل نمط التعبير الدقيق لجين واحد وتحديد مجالات التداخل في التعبير عن اثنين من الجينات. نحن تتضمن يوديد النووية propidium مكافحة وصمة عار لتسليط الضوء على تنظيم الأنسجة.
Abstract
جبل بأكمله
Protocol
1. تثبيت و
- الإصلاح الأجنة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) في برنامج تلفزيوني.
- إزالة الإصلاح ويغسل 2 × برنامج تلفزيوني ، كل 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
- dechorionate يدويا الأجنة في برنامج تلفزيوني في لوحة من الزجاج الاكتئاب باستخدام الملقط ساعاتي. بعد dechorionation ، يتم نقل الأجنة باستخدام الزجاج المصقول النار باستور ماصة لأنها قد التمسك ماصات البولي بروبلين.
- نقل الأجنة من خلال سلسلة من 25 ٪ و 50 ٪ و 75 ٪ في الميثانول برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- استبدال الميثانول السائل مع 100 ٪ ، واحتضان 5 دقائق ثم استبدال الميثانول النقي.
- أجنة في مكان -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن ساعة واحدة. (ونحن عادة احتضان الأجنة بين عشية وضحاها. قياسي في الموقع التهجين ستعمل على الأجنة تخزينها لأكثر من عام ، لكننا لم تتناول ما إذا كان فقدان القرار عالية من فلوري التهجين في الموقع للتخزين لفترات طويلة.)
- غسل الأجنة لمدة 5 دقائق في كل من 75 ٪ و 50 ٪ و 25 ٪ في الميثانول في PBST RT. تغسل مرتين لمدة 5 دقائق في كل PBST في RT.
- الإصلاح مرة أخرى لمدة 20 دقيقة في PFA 4 ٪ في برنامج تلفزيوني في RT.
- تغسل مرتين لمدة 5 دقائق في كل PBST في RT.
مذكرة بشأن PFA :
نقوم بتخزين PFA 4 ٪ في aliquots في C -20 درجة مئوية (انظر الجدول الكواشف). لتثبيت الأولي ، ونحن نستخدم فقط PFA التي لم تكن أبدا إذابة سابقا. تثبيتات لاحقة ، ونحن غالبا ما تستخدم PFA التي تم إذابة سابقا. التثبيت الأولي يبدو أن تكون حاسمة لتلطيخ ناجحة مع هذا البروتوكول.
2. بروتين وPOSTFIXATION
- K هضم مع بروتين (5μg/ml في PBST) في RT لمدة 3 إلى 12 دقيقة لpermeabilize الأجنة. (فترة حضانة يعتمد على عمر الجنين ومراحل الشباب أكثر حساسية ، ويعتمد أيضا على مجموعة من الإنزيمات.) للحصول على أجنة somitogenesis المرحلة ، ونحن permeabilize عادة لمدة 3-4 دقائق. خلال هذه الحضانة ونحن نرسي أنبوب microcentrifuge على جانبها.
- شطف لفترة وجيزة في PBST ويغسل مرة واحدة لمدة 5 دقائق في PBST.
- الإصلاح مرة أخرى لمدة 20 دقيقة في PFA 4 ٪ في برنامج تلفزيوني في RT.
- تغسل مرتين ، لمدة 5 دقائق لكل منهما ، في PBST في RT.
3. PREHYBRIDIZATION
- احتضان الأجنة لمدة 5 دقائق عند 65 درجة مئوية في HYB.
- Prehybridize عند 65 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 في ساعة HYB +.
4. تهجين
- إزالة كافة ولكن 50 ميكرولتر من preHYB ، ولكن تأكد للحفاظ على الاجنة مغمورة تماما.
- إضافة 1-2 ميكرولتر من كل riboprobe (digoxygenin وفلوريسئين المسمى riboprobes) إلى الأجنة والمزيج بلطف بواسطة عبها الأنبوب. كمية التحقيق هو عادة 1 - 2μl من رد فعل التوليف 20μl التحقيق.
- وبالنظر إلى أن فلوريسئين الحساسة للضوء ، ينبغي أن تكون ملفوفة في احباط أنابيب الألومنيوم أو خلاف ذلك تتعرض للضوء الحد الأدنى من هذه النقطة إلى الأمام.
- احتضان الأجنة بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية.
5. إقالة PROBE
علما بأن الحلول من هذا النقص المنظفات النقطة. القضاء على المنظفات ويبدو أن ردود الفعل تلطيخ مساعدة ولكن لا يتسبب في الأجنة لتصبح لزجة نوعا ما.
- إزالة riboprobe.
- غسل 2 × 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية في formamide/2xSSC 50 ٪.
- يغسل لمدة 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية في SSC × 2.
- يغسل لمدة 30 دقيقة 65 درجة مئوية في SSC X 0.2.
6. ANTI - فلوريسئين الضد الحضانة
- كتلة ما لا يقل عن 1 في ساعة RT في 500μl من محلول حمض المالئيك 1X العازلة زائد 2 ٪ كاشف حظر (انظر الجدول الكواشف).
- إضافة الأضداد المضادة للفلوريسئين - POD ، كما تم توفيره من قبل شركة روش ، في التخفيف 1:500 في حل حظر.
- يحضن بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. خلال هذه الحضانة ونحن نرسي أنبوب microcentrifuge على جانبها.
- يغسل 4 × 20 دقيقة في 1X العازلة حمض المالئيك. تغسل مرتين لمدة 5 دقائق في كل برنامج تلفزيوني.
7. كشف فلوريسئين - صفتها PROBE
- احتضان 30-60 دقيقة في محلول TSA فلوريسئين بلس. نحن نرسي (سبين أسفل الركيزة TSA قبل اتخاذ حل تلوين ، وللاطلاع على رد الفعل ، وتمييع كاشف tyramide 01:50 بيركن في التضخيم إلمر العازلة مخفف.) خلال هذه الحضانة ، وأنبوب microcentrifuge على جانبها. يجب تحديد وقت رد الفعل تجريبيا لكل التحقيق. للأسف ، لا يمكن أن يكون رد الفعل تلطيخ رصد بصريا كما هو الركيزة الفلورسنت ، واحد وسوف نرى في كل مكان في جميع أنحاء مضان أخضر التفاعل تلطيخ.
- يغسل لمدة 10 دقيقة في كل من 30 ٪ ، 50 ٪ ، 75 ٪ و 100 ٪ في برنامج تلفزيوني الميثانول.
- احتضان في حل من 1 ٪ H 2 0 2 في الميثانول لمدة 30 دقيقة لإبطال نشاط البيروكسيديز الأولى.
- يغسل كل 10 دقائق في 75 ٪ و 50 ٪ والميثانول بنسبة 30 ٪ في برنامج تلفزيوني. ثم يغسل مرتين لمدة 10 دقيقة في كل برنامج تلفزيوني. فمن المهم أن كل من التقىيمكن إزالة hanol.
ملاحظات على التضخيم SIGNAL TYRAMIDE :
لقد تم استخدام إلمر بيركن أطقم TSA. نجد أن ركائز اليكسا - Tyramide صمة جيدا باستخدام التضخيم إلمر بيركن العازلة مخفف ، ولكن لم يكن لدينا النجاح باستخدام العازلة تلطيخ المتوفرة مع أطقم مجسات Invitrogen / الجزيئية. أخيرا ، وجدنا أن يتم القضاء على Cy5 مضان لاحقة الميثانول / H 2 O 2 العلاج بينما فلوريسئين واليكسا 647 - تتأثر. ويمكن أيضا أن تتأثر سلبا Cy3 من الميثانول / H 2 O 2 العلاج كما هو متعلق هيكليا لCy5. لهذا السبب ، ينبغي أن لا Cy3 وردود الفعل Cy5 TSA أن تستخدم للتفاعل تلطيخ الثانية في الفلورسنت مزدوجة في البروتوكول الموقع.
8. ANTI - Digoxygenin الضد الحضانة
- كتلة الأجنة مرة أخرى لمدة لا تقل عن 1 في ساعة RT في محلول حمض المالئيك 1X العازلة زائد 2 ٪ كاشف حظر.
- إضافة الأضداد المضادة POD - DIG كما قدمتها شركة روش في التخفيف 1:1000 في عرقلة الحل أعلاه
- يحضن بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. خلال هذه الحضانة ونحن نرسي أنبوب microcentrifuge على جانبها.
- يغسل 4 × 20 دقيقة في 1X العازلة حمض المالئيك. تغسل مرتين لمدة 5 دقائق في كل برنامج تلفزيوني.
9. كشف Digoxygenin - صفتها PROBE
- نحن نرسي احتضان 30-60 دقيقة في TSA بلس Cy5 محلول (سبين أسفل الركيزة TSA قبل اتخاذ حل تلوين ، وللاطلاع على رد الفعل ، وتمييع كاشف tyramide 01:50 العازلة في التضخيم مخفف) وخلال هذه الحضانة ، وأنبوب microcentrifuge على جانبها. يجب تحديد وقت رد الفعل تجريبيا لكل التحقيق.
- يغسل ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة في كل PBST.
10. PROPIDIUM يوديد تلطيخ
- تغسل مرتين لمدة 5 دقائق في كل من محكمة أمن الدولة × 2.
- احتضان الأجنة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في 50 ميكرولتر SSCT × 2 مع 10 ريبونوكلياز ميكرولتر (لتركيز النهائي من 100μg/ml).
- غسل ست مرات لمدة 3 دقائق في كل من محكمة أمن الدولة في RT × 2.
- وصمة عار الأجنة لمدة 8 دقائق في محلول يوديد propidium 330μg/ml في SSC × 2.
- غسل ست مرات لمدة 3 دقائق في كل من محكمة أمن الدولة في RT × 2.
- الإصلاح لمدة 20 دقيقة في PFA 4 ٪ في برنامج تلفزيوني في RT.
- تغسل مرتين ، لمدة 5 دقائق لكل منهما ، في PBST في RT.
11. متزايد
- احتضان الأجنة لمدة 10 دقيقة في كل من 25 ٪ و 50 ٪ في الجلسرين PBST. واضح بين عشية وضحاها في الجلسرين 75 ٪ عند 4 درجة مئوية.
- ونحن تشريح deyolk الأجنة وجبل مسطح منهم على شريحة المجهر. يمكن أن تنتج كبيرة صفار مضان الخلفية. تشريح هو أسهل بكثير بعد أجنة مسحت ovenight في gylcerol.
الحلول :
| PBST | PBS توين زائد 0.1 ٪ | |
| SSCT | SSC زائد توين 0.1 ٪ | |
| HYB - | 50 ٪ formamide 5xSSC 0.1 ٪ توين - 20 | |
| HYB + | HYB - 5mg/ml بالمستخفيات (خميرة) RNA 50μg/ml الهيبارين | مستعدة RNA بالمستخفيات بواسطة بروتين الهضم K من الحمض النووي الريبي لاحقة مع الفينول ، الفينول كلوروفورم ، وعجلت كلوروفورم extraction.The RNA والذائبة في الماء DEPC المعاملة. |
| 1 × العازلة حمض المالئيك | 150mM حمض المالئيك ، 100mM كلوريد الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7.5) |
الشكل 1. نتائج ممثل جبل بأكمله الفلورسنت مزدوجة في الموقع التهجين. (AC). الصور تدل على باب واحد متحد البؤر من خلال المنطقة الخلفية من الزرد الجنين في مرحلة العشر الجسيدة. ومن وجهة النظر مع الظهرية الأمامية إلى الأعلى. ملطخة النوى مع يوديد propidium زرقاء اللون. (A) تم الكشف عن deltaC مرنا باستخدام riboprobe digoxygenin المسمى وكاشف TSA - Cy5. (ب) من كتب مرنا الجين her1 تم الكشف مع riboprobe فلوريسئين المسمى وكاشف TSA - فلوريسئين. (ج) دمج قنوات خضراء وحمراء لا لبس فيها تحدد مناطق مختلفة التعبير الجيني أو تداخل الجينات اثنين. (D ، E) تفاصيل her1 التعبير يدل على دقة عالية من هذا الإجراء. يمكن أن يكون مرنا للتوطين التحت خلوية تمييزها بوضوح. السهام تشير إلى خلية نشطة معرض النسخ ، التي كشفت عنها نقاط من تلطيخ في النواة. سهام تشير إلى وجود خلية حشوية تظهر الترجمة من مرنا. (F ، G) مزدوج لتلطيخ her1 وdeltaC يكشف الخلايا التي يتم تدوين كل من الجينات (رأس السهم الأبيض) ، أو بإحدى هاتين العقوبتين الجين بشكل منفصل (السهام الحمراء والخضراء).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول المعروضة هنا يعمل بشكل جيد مع التحقيقات التي تعطي إشارة قوية نظيفة بعد تلطيخ عن 30-45 دقيقة في الفوسفاتاز القلوية ، توسطت فيه رد فعل نموذجي. قبل تنفيذ بروتوكول فلوري التهجين في الموقع ، ونحن لدينا دائما اختبار تحقيقات باستخدام معيار غير الفلورسنت البروتوكول (المنصوص عليها في المواد التكميلية جنبا إلى جنب مع لجنة التحقيق بروتوكول التوليف). لقد كان لدينا أقل نجاحا مع فلوري التهجين في البروتوكول الموقع عند استخدام مجسات الأضعف ، ولكن قد يكون من الممكن في بعض الحالات. لقد نجحنا في الجمع بين فلوري التهجين في البروتوكول الموقع مع immunolocalization من β - catenin 3. عند تنفيذ هذا الاختلاف ، ونحن نفعل في HYB ، HYB + وحضانات التهجين عند 55 درجة مئوية بدلا من 65 درجة مئوية كما الحواتم ويبدو أن الحفاظ على أفضل في انخفاض درجة الحرارة. يتم تنفيذ حضانات immunolocalization بعد ردود الفعل TSA.
منذ فلوريسئين المسمى تحقيقات عموما أضعف من تحقيق - digoxygenin المسمى لهذا الجين نفسه ، فإننا عادة ما تصور التحقيق فلوريسئين ذات العلامات الأولى. مثيل واحد حيث يمكن للمرء أن يتخيل تريد التحقيق digoxygenin الأول هو إذا أعرب أحد الجينين على مستوى منخفض. في هذه الحالة ، واحد يجعل digoxygenin - riboprobe للجينات ضعيفة والبقع لأنها أول إشارة إلى تحقيق أقصى قدر من الضوضاء. علما انه اذا كنت تصور الثانية فلوريسئين التحقيق ، يجب أن لا تصور التحقيق مع digoxygenin TSA فلوريسئين كما الأضداد المضادة للفلوريسئين سيتعرف TSA صمة فضلا عن riboprobe فلوريسئين المسمى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نود أن نعترف إسهامات جوليتش Dörthe ، الجولة جنيفر وأندرو مارا في تطوير هذا البروتوكول. دعم البحوث المقدمة من معاهد الصحة القومية ، والجمعية الأميركية للسرطان ، ومارس من الدايمات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C |
| Proteinase K, recombinant PCR grade | Roche Group | 03115879001 | Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C |
| Blocking Reagent | Roche Group | 11096176001 | Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws. |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche Group | 11426346910 | Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C. |
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche Group | 11207739910 | As above. |
| TSA Plus Fluorescein system | PerkinElmer, Inc. | NEL741001KT | Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C. |
| TSA Plus Cyanine5 system | PerkinElmer, Inc. | NEL745001KT | As above |
| TSA Plus Cyanine3 system | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT | As above |
| TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG) | Molecular Probes, Life Technologies | T20926 | Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C. |
| RNase, DNase free | Roche Group | 11119915001 | Supplied as 500μg/ml solution |
| Propidium Iodide | Molecular Probes, Life Technologies | P-3566 | Supplied as 1mg/ml solution in water. |
References
- Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
- Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23, 345-358 (2001).
- Jülich, D. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
- Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC. Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).
- Lecuyer, E. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
