Summary
Hela montera in situ hybridisering är en av de mest använda teknikerna i utvecklingsbiologi. Här presenterar vi en högupplöst dubbel fluorescent in situ hybridisering protokollet för att analysera den exakta uttrycket mönster av en enda gen och för att bestämma överlappningen av uttrycket domäner två gener. Vi inkluderar en propidiumjodid kärnvapen mot-bets för att markera vävnad organisation.
Abstract
Hela montera
Protocol
1. FIXERING
- Fix embryon över natten vid 4 ° C med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS.
- Ta fixa och tvätta 2 x PBS, 5 minuter i rumstemperatur (RT).
- Manuellt dechorionate embryon i PBS i ett glas depression tallrik med urmakare pincett. Efter dechorionation är embryon med hjälp av en brand-polerat glas pasteurpipett eftersom de kan hålla sig till polypropylen pipetter.
- Överför embryon genom en serie av 25%, 50% och 75% metanol i PBS i 5 minuter vardera.
- Byt vätska med 100% metanol, inkubera 5 minuter och sedan ersätta med färsk metanol.
- Placera embryon vid -20 ° C i minst en timme. (Vi inkubera vanligtvis embryona natten. Standard in situ hybridisering kommer att arbeta på embryon som lagrats i mer än ett år, men vi har inte undersökt om den högupplösta av fluorescent in situ hybridisering går förlorad vid långvarig lagring.)
- Tvätta embryon för 5 minuter i 75%, 50%, 25% metanol i PBST vid RT. Tvätta två gånger i 5 minuter vardera i PBST vid RT.
- Fix igen för 20 minuter i 4% PFA i PBS vid RT.
- Tvätta två gånger i 5 minuter vardera i PBST vid RT.
ANMÄRKNING FÖR PFA:
Vi sparar 4% PFA i alikvoter vid -20 º C (se tabell över reagenser). För det första fixering använder vi bara PFA som aldrig tidigare har tinats. För efterföljande upptagningar, använder vi ofta PFA som tidigare har tinats. Den initiala fixering tycks vara avgörande för framgångsrik färgning med detta protokoll.
2. Proteinas OCH POSTFIXATION
- Digest med proteinas K (5μg/ml i PBST) vid RT i 3 till 12 minuter för att permeabilize embryona. (Inkubationstiden beror på ålder av embryon som yngre stadier är mer känsliga. Det beror också på partiet av enzym.) För embryon somitogenesis skede, vi brukar permeabilize i 3-4 minuter. Under denna inkubation lägger vi mikrocentrifugrör på sin sida.
- Skölj kortfattat i PBST och tvätta en gång i 5 minuter i PBST.
- Fix igen för 20 minuter i 4% PFA i PBS vid RT.
- Tvätta två gånger, i 5 minuter vardera i PBST vid RT.
3. PREHYBRIDIZATION
- Inkubera embryon för 5 minuter vid 65 º C i Hyb-.
- Prehybridize vid 65 ° C i minst 1 timme i Hyb +.
4. Hybridisering
- Ta bort alla utom 50 ìl av preHYB, men se till att hålla embryon helt under vatten.
- Tillsätt 1-2 l av varje riboprobe (digoxygenin-och fluorescein-märkta riboprobes) till embryon och blanda genom att försiktigt vicka röret. Mängden Sonden är normalt 1-2μl från en 20μl sond syntes reaktion.
- Med tanke på att fluorescein är ljuskänsligt bör rören vara insvept i aluminiumfolie eller på annat sätt utsätts för minimal ljuset från denna punkt framåt.
- Inkubera embryon över natten vid 65 º C.
5. PROBE DEMONTERING
Observera att lösningarna från denna punkt framåt brist tvättmedel. Eliminering av diskmedel tycks hjälpa fläckar reaktioner, men orsakar de embryon som blir ganska kladdig.
- Ta bort riboprobe.
- Tvätta 2 x 30 minuter vid 65 º C i 50% formamide/2xSSC.
- Tvätta i 15 minuter vid 65 º C i 2 x SSC.
- Tvätta i 30 minuter 65 ° C i 0,2 x SSC.
6. ANTI-Fluorescein ANTIKROPP INKUBATION
- Block i minst 1 timme vid strålbehandling i 500μl av en lösning av 1x maleinsyra buffert plus 2% Blocking Reagent (se tabell över reagenser).
- Lägg till anti-Fluorescein-POD antikropp, som levereras av Roche, på en 1:500 utspädning i den blockerande lösningen.
- Inkubera över natten vid 4 º C. Under denna inkubation lägger vi mikrocentrifugrör på sin sida.
- Tvätta 4 x 20 minuter i 1x maleinsyra buffert. Tvätta två gånger för 5 minuter i PBS.
7. DETEKTERING av fluorescein-MÄRKTA PROBE
- Inkubera 30-60 minuter i TSA Plus Fluorescein Solution. (Spinn ner TSA underlaget innan färglösningen. För reaktionen, späd tyramide reagens 1:50 i Perkin Elmer förstärkning spädningsvätska buffert.) Under denna inkubation, lägger vi mikrocentrifugrör på sin sida. Reaktionstid måste bestämmas empiriskt för varje givare. Tyvärr kan färgningen reaktionen inte vara visuellt övervakas som substrat är fluorescerande och en kommer att se överallt grön fluorescens hela färgning reaktion.
- Tvätta i 10 minuter vardera i 30%, 50%, 75% och 100% metanol i PBS.
- Inkubera i en lösning av 1% H 2 0 2 i metanol i 30 minuter för att inaktivera den första peroxidas.
- Tvätta 10 minuter i 75%, 50% och 30% metanol i PBS. Tvätta sedan två gånger på 10 minuter vardera i PBS. Det är viktigt att alla möttehanol tas bort.
NOTER TILL TYRAMIDE signalförstärkning:
Vi har använt Perkin Elmer TSA Kit. Vi finner att Alexa-Tyramide substrat fläck väl med Perkin Elmer bufferten förstärkning spädningsvätska, men vi har inte haft framgång med hjälp av färgning bufferten som medföljer Invitrogen / molekylära sonder Kit. Slutligen har vi funnit att Cy5 fluorescens elimineras genom efterföljande metanol / H 2 O 2 behandling medan fluorescein och Alexa-647 påverkas inte. Cy3 kan också påverkas negativt av metanol / H 2 O 2 behandling eftersom den är strukturellt besläktad med Cy5. Av denna anledning bör Cy3 och Cy5 TSA reaktioner endast användas för den andra färgning reaktion i en dubbel fluorescent in situ-protokollet.
8. ANTI-Digoxygenin ANTIKROPP INKUBATION
- Blockera embryona igen i minst 1 timme vid strålbehandling i en lösning av 1x maleinsyra buffert plus 2% blockera reagens.
- Lägg till anti-DIG POD antikropp som tillhandahålls av Roche på en 1:1000 utspädning i ovan blockerande lösningen
- Inkubera över natten vid 4 º C. Under denna inkubation lägger vi mikrocentrifugrör på sin sida.
- Tvätta 4 x 20 minuter i 1x maleinsyra buffert. Tvätta två gånger för 5 minuter i PBS.
9. PÅVISA Digoxygenin-MÄRKTA PROBE
- Inkubera 30-60 minuter i TSA Plus Cy5 Solution (spinn ner TSA underlaget innan färglösningen. För reaktionen, späd tyramide reagens 1:50 i förstärkning spädningsvätska buffert) Under denna inkubation, lägger vi mikrocentrifugrör på sin sida. Reaktionstid måste bestämmas empiriskt för varje givare.
- Tvätta tre gånger på 10 minuter vardera i PBST.
10. Propidiumjodid FÄRGNING
- Tvätta två gånger i 5 minuter vardera i 2 x SSC.
- Inkubera embryon i 30 minuter vid 37 ° C i 50 l 2 x SSCT med 10 l RNAse (för en slutlig koncentration av 100μg/ml).
- Tvätta sex gånger i 3 minuter vardera i 2 x SSC vid RT.
- Stain embryon i 8 minuter i en lösning av 330μg/ml propidiumjodid i 2 x SSC.
- Tvätta sex gånger i 3 minuter vardera i 2 x SSC vid RT.
- Fix för 20 minuter i 4% PFA i PBS vid RT.
- Tvätta två gånger, i 5 minuter vardera i PBST vid RT.
11. MONTERING
- Inkubera embryon för 10 minuter vardera i 25% och 50% glycerol i PBST. Klart över natten i 75% glycerol vid 4 º C.
- Vi dissekera och deyolk embryon och platt montera dem på ett objektglas. Äggulan kan ge betydande bakgrundsfluorescens. Dissektion är mycket lättare efter att embryona har rensat ovenight i gylcerol.
LÖSNINGAR:
| PBST | PBS plus 0,1% Tween | |
| SSCT | SSC plus 0,1% Tween | |
| Hyb- | 50% formamid 5xSSC 0,1% Tween-20 | |
| Hyb + | Hyb- 5mg/ml torula (jäst) RNA 50μg/ml heparin | Den torula RNA är utarbetad av proteinas K rötning av RNA med påföljande fenol-, fenol-kloroform-, och kloroform-extraction.The RNA fälls och upplöses i DEPC-behandlat vatten. |
| 1 x maleinsyra buffert | 150mm maleinsyra, 100mm NaCl (pH 7,5) |
Figur 1. Representativa resultat för hela montera dubbla fluorescent in situ hybridisering. (AC). Bilderna visar en konfokala snitt genom den bakre regionen av en zebrafisk embryo vid tio-somit skede. Utsikten är rygg med främre till toppen. Kärnor färgas med propidiumjodid är blåfärgad. (A) deltaC mRNA upptäcktes med hjälp av en digoxygenin märkt riboprobe och TSA-Cy5 reagens. (B) mRNA transkriberas från HER1 genen upptäcktes med fluorescein-märkta riboprobe och TSA-fluorescein reagens. (C) sammanslagning av de gröna och röda kanaler entydigt identifierar regioner i olika eller överlappande genuttryck av de två generna. (D, E) Detalj av HER1 uttryck som visar den höga upplösningen av detta förfarande. Subcellulära lokalisering av mRNA klart kan skönjas. Pilspetsar visar en cell uppvisar aktiv transkription, avslöjades av prickar av färgning i kärnan. Pilar indikerar en cell som visar cytoplasmiska lokalisering av mRNA. (F, G) Dubbel färgning för HER1 och deltaC avslöjar celler som transkribera både gener (vit pil) eller antingen gen separat (röda och gröna pilar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet presenteras här fungerar bra med sonder som ger en ren stark signal efter färgning i 30-45 minuter i en typisk alkalisk fosfatas-medierad reaktion. Innan du utför fluorescent in situ hybridisering protokollet, testar vi alltid våra givare på det standardformulär icke fluorescerande protokoll (lämnas i kompletterande material tillsammans med sonden syntes protokoll). Vi har haft mindre framgång med fluorescent in situ hybridisering-protokollet när du använder svagare prober, men det kan vara möjligt i vissa fall. Vi har framgångsrikt kombinerat fluorescent in situ hybridisering protokoll med immunolocalization av β-catenin 3. När du utför denna variation gör vi Hyb-, Hyb + och hybridisering inkubationer vid 55 ° C istället för 65 ° C som epitoper verkar bevaras bättre vid lägre temperatur. Den immunolocalization inkubationer utförs efter TSA reaktioner.
Eftersom fluorescein-märkta prober är generellt svagare än en digoxygenin märkt sond för samma gen, visualisera vi vanligtvis fluorescein-märkta sonden först. Ett exempel där man kanske vill visualisera digoxygenin sonden första är om en av de två generna uttrycks på en låg nivå. I det här fallet gör en en digoxygenin-riboprobe för de svaga genen och fläckar på den först för att maximera signal-brus. Observera att om du visualiserar fluorescein sonden andra, bör du inte visualisera digoxygenin sonden med fluorescein TSA som den anti-fluorescein antikroppar kommer att känna igen TSA fläcken liksom fluorescein-märkta riboprobe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vill tacka för bidragen från Dorthe Jülich, Jennifer runda och Andrew Mara i utvecklingen av detta protokoll. Forskningsstöd från NICHD, American Cancer Society och March of Dimes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C |
| Proteinase K, recombinant PCR grade | Roche Group | 03115879001 | Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C |
| Blocking Reagent | Roche Group | 11096176001 | Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws. |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche Group | 11426346910 | Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C. |
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche Group | 11207739910 | As above. |
| TSA Plus Fluorescein system | PerkinElmer, Inc. | NEL741001KT | Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C. |
| TSA Plus Cyanine5 system | PerkinElmer, Inc. | NEL745001KT | As above |
| TSA Plus Cyanine3 system | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT | As above |
| TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG) | Molecular Probes, Life Technologies | T20926 | Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C. |
| RNase, DNase free | Roche Group | 11119915001 | Supplied as 500μg/ml solution |
| Propidium Iodide | Molecular Probes, Life Technologies | P-3566 | Supplied as 1mg/ml solution in water. |
References
- Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
- Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23, 345-358 (2001).
- Jülich, D. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
- Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC. Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).
- Lecuyer, E. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
