Summary
In situ hibridizasyon Tüm montaj, gelişim biyolojisi en yaygın olarak kullanılan teknikleri biridir. Burada, tek bir genin kesin ifadelerde desen analiz ve iki genin ifadesi etki çakışma belirlenmesi için çift floresan in situ hibridizasyon protokol yüksek çözünürlüklü sunuyoruz. Biz bir doku organizasyon vurgulamak için propidium iyodür nükleer karşı leke içerir.
Abstract
Tüm montaj
Protocol
1. FİKSASYON
- Fix 4 geceleme embriyolar ° C PBS içinde% 4 paraformaldehid (PFA).
- Kaldır düzeltmek ve oda sıcaklığında (RT) 2 x PBS, her 5 dakika yıkayın.
- Saatçi forseps kullanarak bir bardak depresyon plaka PBS Manuel dechorionate embriyolar. Polipropilen pipetler yapışabilir dechorionation sonra, embriyolar bir yangın parlatılmış cam Pasteur pipeti kullanılarak aktarılır.
- Her 5 dakika için bir dizi% 25,% 50 ve PBS içinde% 75 metanol ile embriyo transferine.
- % 100 metanol ile sıvı değiştirin, inkübasyon ve 5 dakika sonra taze metanol ile değiştirin.
- En az bir saat için -20 ° C'de Yeri embriyolar. (Biz genellikle in situ hibridizasyon Standart bir yıldan daha fazla süre saklanan embriyolar üzerinde çalışacak. Gecede embriyoların inkübe, ancak biz değil, uzun süreli depolama floresan in situ hibridizasyon yüksek çözünürlüklü kayıp olup olmadığı incelenir.)
- 5 dakika% 75,% 50,% 25 RT PBST metanol embriyolar yıkayın. RT az 5 dakika PBST içinde her biri için iki kez yıkayın.
- 4 RT PBS içinde% PFA 20 dakika için tekrar sabitleyin.
- RT az 5 dakika PBST içinde her biri için iki kez yıkayın.
PFA İLGİLİ NOT:
(Reaktiflerin tabloya bakınız), -20 º C'de alikotları% 4 PFA depolar. Ilk sabitleme için, biz sadece daha önceden çözülmüş olmamıştı PFA kullanabilirsiniz. Sonraki tespitler, genellikle daha önceden çözülmüş olduğunu PFA kullanmak. Ilk fiksasyon bu protokol ile başarılı bir şekilde boyanması için kritik görünüyor.
2. Proteinaz ve Postfiksasyon
- Embriyoların permeabilize 3 ila 12 dakika RT proteinaz K (PBST içinde 5μg/ml) ile Digest. (Inkübasyon süresi, genç aşamalarında daha duyarlı olmaları nedeniyle embriyoların yaşına bağlıdır. Aynı zamanda, enzim toplu bağlıdır.) Somitogenesis dönem embriyoların için, genellikle 3-4 dakika permeabilize. Bu İnkübasyon sırasında, mikrosantrifüj tüp yan yattı.
- PBST kısaca durulayın ve PBST 5 dakika için bir kez yıkayın.
- 4 RT PBS içinde% PFA 20 dakika için tekrar sabitleyin.
- RT PBST, her 5 dakika için, iki kez yıkayın.
3. PREHYBRIDIZATION
- Embriyoların 65 º C'de 5 dakika inkübe HYB.
- HYB en az 1 saat 65 º C'de Prehybridize.
4. Melezleme
- Ama preHYB 50 ul çıkarın, ancak tamamen sular altında embriyolar tutmak için emin olun.
- Tüp hafifçe Flicking embriyo ve karıştırmak için her Spastine Özgü Riboprop 1-2 ul (digoxygenin ve floresein etiketli riboprobes) ekleyin. Prob miktarı genellikle 1-2μl 20μl prob sentez reaksiyonu.
- Floresein ışığa duyarlı olduğu göz önüne alındığında, tüpler alüminyum folyo ile sarılmış veya başka bir şekilde bu noktadan itibaren en az ışığa maruz olmalıdır.
- Embriyoların gece 65 º C'de inkübe
5. PROBE GİDERİLMESİ
Bu noktadan ileriye eksikliği deterjan çözümler unutmayın. Deterjan giderilmesi boyama reaksiyonları yardımcı olmak için görünür ama embriyoların oldukça yapışkan hale neden.
- Spastine Özgü Riboprop çıkarın.
- 65 º C'de% 50 formamide/2xSSC içinde 2 x 30 dakika yıkayın.
- 2 x SSC 65 º C'de 15 dakika süreyle yıkayın.
- 0.2 x SSC - 65 º C 'de 30 dakika süreyle yıkayın.
6. ANTİ-floresein ANTİKOR KULUÇKA
- 1x maleik asit tampon artı% 2 engelleme reaktifi (reaktiflerin tabloya bakınız) bir çözüm 500μl oda sıcaklığında en az 1 saat Blok.
- Roche tarafından verilen anti-Floresein-POD antikor, 1:500 dilüsyon engelleme çözüm ekleyin.
- 4 º C'de bir gece inkübe Bu İnkübasyon sırasında, mikrosantrifüj tüp yan yattı.
- 1x maleik asit tampon 4 x 20 dakika yıkayın. PBS içinde her 5 dakika için iki kez yıkayın.
7. Floresein Etiketli SONDA VE ALGILAMA
- TSA Plus Floresein Çözüm 30-60 dakika inkübe edin. (Reaksiyon için boyama çözüm yapmadan önce TSA substrat aşağı Spin tyramide reaktif Perkin Elmer amplifikasyon seyreltici tampon 01:50 sulandırmak.) Bu kuluçka sırasında, yan mikrosantrifüj tüp yatıyordu. Reaksiyon zamanı, her sonda için ampirik olarak tespit edilmelidir. Ne yazık ki, boyama reaksiyon yüzey floresan gibi görsel olarak izlenebilir edemez ve bir boyama reaksiyon boyunca her yerde yeşil floresan göreceksiniz.
- % 30,% 50,% 75 ve% 100 PBS içinde metanol her biri için 10 dakika yıkayın.
- Ilk peroksidaz inaktive etmek için 30 dakika boyunca metanol,% 1 H 2 0 2 bir çözüm inkübe edin .
- % 75,% 50 ve% 30 metanol PBS içinde her biri 10 dakika yıkayın. Sonra her biri 10 dakika PBS içinde iki kez yıkayın. Bu önemli olduğunu görüştü, tümhanol kaldırıldı.
TYRAMIDE SİNYAL YÜKSELTME İLE İLGİLİ NOTLAR:
Biz Perkin Elmer TSA Kitleri kullanıyoruz. Alexa-Tyramide yüzeyler Perkin Elmer amplifikasyon seyreltici tampon kullanarak leke olduğunu bulmak, ama biz Invitrogen / Moleküler Problar Kitleri ile sağlanan boyama tampon kullanarak başarılı olmadı. Son olarak, floresein ve Alexa-647 etkilenmez Cy5 floresan sonraki Metanol / H 2 O 2 tedavisi ile ortadan olduğunu bulduk. Cy3 yapısal Cy5 ile ilgili olarak Metanol / H 2 O 2 tedavisi de olumsuz etkilenebilir. Bu nedenle, Cy3 ve Cy5 TSA reaksiyonlar sadece bir çift floresan in situ protokolde ikinci boyama reaksiyon için kullanılan olmalıdır.
8. ANTİ-Digoxygenin ANTİKOR KULUÇKA
- 1x maleik asit tampon artı% 2 engelleme reaktif bir çözüm oda sıcaklığında en az 1 saat embriyoların tekrar engelleyin.
- Yukarıdaki çözüm engelleme 1:1000 dilüsyon Roche tarafından verilen anti-DIG POD antikor ekle
- 4 º C'de bir gece inkübe Bu İnkübasyon sırasında, mikrosantrifüj tüp yan yattı.
- 1x maleik asit tampon 4 x 20 dakika yıkayın. PBS içinde her 5 dakika için iki kez yıkayın.
9 - Digoxygenin Etiketli SONDA VE ALGILAMA
- (TSA substrat aşağı boyama çözüm yapmadan önce Spin reaksiyonu, amplifikasyon seyreltici tampon tyramide reaktif 01:50 sulandırmak) TSA Plus Cy5 Çözüm 30-60 dakika inkübe bu kuluçka sırasında, yan mikrosantrifüj tüp yatıyordu. Reaksiyon zamanı, her sonda için ampirik olarak tespit edilmelidir.
- PBST içinde her 10 dakikada üç kez yıkayın.
10 Propidium iyodür BOYAMA
- 2 x SSC her 5 dakika için iki kez yıkayın.
- 37 az 30 dakika boyunca inkübe embriyolar ° C, 10 ul RNAse (100μg/ml son bir konsantrasyon için) ile 50 ul 2 x SSCT.
- RT az 2 x SSC her 3 dakikada altı kez yıkayın.
- 8 dakika 2 x SSC 330μg/ml propidium iyodür bir çözüm için embriyolar Leke.
- RT az 2 x SSC her 3 dakikada altı kez yıkayın.
- 4 oda sıcaklığında PBS içinde% PFA 20 dakika saptamak için.
- RT PBST, her 5 dakika için, iki kez yıkayın.
11. MONTAJ
- Embriyoların her biri% 25 ve PBST% 50 gliserol 10 dakika inkübe edin. 4 º C'de% 75 gliserol gecede temizleyin
- Biz incelemek ve deyolk embriyoların ve düz bir mikroskop lamı üzerine monte. Yumurta sarısı önemli bir eşiğe üretebilir. Diseksiyon embriyolar gylcerol ovenight temizlenir sonra çok daha kolay.
ÇÖZÜMLER:
| PBST | PBS artı% 0.1 Tween | |
| SSCT | SSC artı% 0.1 Tween | |
| HYB- | 50% formamid 5xSSC % 0.1 Tween-20 | |
| HYB + | HYB- 5mg/ml Torula (maya) RNA 50μg/ml heparin | Torula RNA RNA proteinaz K sindirimi tarafından hazırlanan sonraki fenol, fenol-kloroform ve kloroform-extraction.The RNA çöktürülmüş ve DEPC arıtılmış su içinde çözünmüş. |
| 1 x maleik asit tampon | 150mm maleik asit, 100 mM NaCl (pH 7.5) |
Şekil 1 tüm montaj Temsilcisi sonuçları çift floresan in situ hibridizasyon. (AC). Görüntüler zebrafish on hücre gruplarının aşamada embriyo posterior bölge üzerinden tek bir konfokal bölümünde gösteriyor. Görünümü, üst anterior ile birlikte dorsal. Propidium iyodür ile Çekirdekler boyanmış mavi renkli. (A) deltaC mRNA bir digoxygenin etiketli Spastine Özgü Riboprop ve TSA-Cy5 reaktif kullanılarak tespit edildi. (B) her1 gen transkripsiyonu mRNA bir floresein etiketli Spastine Özgü Riboprop ve TSA-floresein reaktifi ile tespit edildi. (C) net bir şekilde yeşil ve kırmızı kanalları birleştirme iki gen veya örtüşen farklı gen ifade bölgeleri tanımlar. (D, E) Bu prosedürün yüksek çözünürlük göstermektedir. Her1 ifade Detay MRNA hücre içi lokalizasyonu açıkça ayırt edilebilir. Arrowheads çekirdeğinde boyama noktalar ortaya koyduğu aktif transkripsiyon sergileyen bir hücre göstermektedir. Oklar mRNA sitoplazmik lokalizasyon gösteren bir hücre göstermektedir. Her1 ve deltaC için (F, G) Çift boyama, hem genler (beyaz ok ucu), ya da ayrı ayrı gen (kırmızı ve yeşil ok başları) transkripsiyonu hücreleri ortaya koymaktadır .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan protokol tipik bir alkalin fosfataz aracılı reaksiyon 30-45 dakika boyandıktan sonra temiz ve güçlü bir sinyal vermek problar ile iyi çalışır. Floresan in situ hibridizasyon protokolü performans öncesinde, her zaman bizim probları standart floresan olmayan protokolü (prob sentezi protokolü ile birlikte tamamlayıcı malzeme) kullanarak test edin. Zayıf problar kullanarak, floresan in situ hibridizasyon protokol az başarı oldu, ama bazı durumlarda mümkün olabilir. Β-katenin 3 immunolocalization in situ hibridizasyon protokolü başarıyla floresan kombine var. Bu değişimi yaparken, biz HYB-HYB + ve hibridizasyon inkubasyon 55 ° C yerine 65 ° C epitoplar düşük sıcaklıkta daha iyi korunacak göründükleri gibi. Immunolocalization inkubasyon TSA reaksiyonları sonra yapılır.
Floresein-etiketli probları genellikle aynı genin bir digoxygenin etiketli prob daha zayıf olduğundan, genellikle ilk floresein etiketli prob görselleştirmek. Iki genin biri, düşük bir düzeyde ifade ise, bir ilk digoxygenin prob görselleştirmek isteyebilirsiniz örneklerinden biridir. Bu durumda, bir zayıf bir gen ve bunun için lekeleri ve gürültü sinyali en üst düzeye çıkarmak için ilk bir digoxygenin Spastine Özgü Riboprop yapar. Floresein prob ikinci görselleştirmek, anti-floresein antikor TSA yanı floresein etiketli Spastine Özgü Riboprop olarak leke tanıyacak olarak floresein TSA ile digoxygenin sonda görüntülenemedi gerektiğini unutmayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz bu protokolü geliştirme Dörthe Jülich, Jennifer Yuvarlak ve Andrew Mara katkılarını kabul etmek istiyorum. NICHD, Amerikan Kanser Derneği ve Dimes Mart tarafından sağlanan araştırma desteği.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C |
| Proteinase K, recombinant PCR grade | Roche Group | 03115879001 | Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C |
| Blocking Reagent | Roche Group | 11096176001 | Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws. |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche Group | 11426346910 | Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C. |
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche Group | 11207739910 | As above. |
| TSA Plus Fluorescein system | PerkinElmer, Inc. | NEL741001KT | Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C. |
| TSA Plus Cyanine5 system | PerkinElmer, Inc. | NEL745001KT | As above |
| TSA Plus Cyanine3 system | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT | As above |
| TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG) | Molecular Probes, Life Technologies | T20926 | Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C. |
| RNase, DNase free | Roche Group | 11119915001 | Supplied as 500μg/ml solution |
| Propidium Iodide | Molecular Probes, Life Technologies | P-3566 | Supplied as 1mg/ml solution in water. |
References
- Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
- Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23, 345-358 (2001).
- Jülich, D. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
- Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC. Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).
- Lecuyer, E. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
