Summary
현장 하이브리드화의 전체 마운트 발달 생물학에서 가장 널리 사용되는 기법 중 하나입니다. 여기, 우리는 단일 유전자의 정확한 표현 패턴을 분석하는 두 유전자의 표현 도메인의 중복을 결정하는 현장 하이브리드화 프로토콜을 두 번 형광 높은 해상도를 제시한다. 우리는 조직 조직을 강조하기 위해 propidium 요오드화물 핵 카운터 얼룩이 포함됩니다.
Abstract
전체 마운트
Protocol
1. 정치
- 4 박 배아 ° C PBS에 4 % paraformaldehyde (PFA)와. 문제를 해결
- 삭제 수정하고 실온 (RT)에서 2 X PBS 5 분 각각 씻으십시오.
- 시계 제조인의 집게를 사용하여 유리 우울증 플레이트의 PBS에서 수동으로 dechorionate 배아. 그들은 폴리 프로필렌의 pipettes에 충실 수 있으므로 dechorionation 후, 배아는 불을 광택 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 전송됩니다.
- 오분 각 25 %의 일련의 50 %와 PBS의 75 % 메탄올을 통해 배아를 전송합니다.
- 100 % 메탄올로 액체를 교체, 새로운 메탄올로 교체 후 5 분 부화합니다.
- 1 시간 최소 -20 ° C에서 장소 배아. (우리는 일반적으로 현장 하이브 리다이 제이션의 표준은 년 이상 보관 배아에서 작동합니다. 하룻밤 배아를 품어,하지만 우리는 현장 하이브리드화에 형광의 높은 해상도가 장기간 보관하여 분실 여부를 검사하지 않았습니다.)
- 75 % 오분 각각 50 %, RT에서 PBST에서 25 %의 메탄올을위한 배아를 씻으십시오. RT에서 오분 PBST에서 각각에 대해 두 번 씻으십시오.
- RT에서 PBS에 4퍼센트 PFA에 20 분 다시 수정.
- RT에서 오분 PBST에서 각각에 대해 두 번 씻으십시오.
PFA에 관한 참고 :
우리는 (시약의 표 참조) -20 º C에서 aliquots에 4% PFA를 저장합니다. 초기 고정을 위해, 우리는 이전에 해동 적이있다는 PFA를 사용합니다. 이후 fixations 들어, 우리는 종종 이전 해동했다는 PFA를 사용합니다. 초기 고정이 절차를 성공적으로 얼룩을 위해 중요한 것 같습니다.
2. PROTEINASE 및 POSTFIXATION
- 배아를 permeabilize하는 3~12분에 대한 RT에서 proteinase K (PBST에 5μg/ml)와 다이제스트. (부화 시간은 젊은 단계 더 구분으로 태아의 나이에 따라 달라집니다. 또한 효소의 배치에 따라 다릅니다.) somitogenesis 스테이지 배아의, 우리가 일반적으로 3~4분에 대한 permeabilize. 이 부화하는 동안, 우리는 측면에 microcentrifuge 관하다.
- PBST에서 잠시 씻어 PBST로 5 분 한 번 씻는다.
- RT에서 PBS에 4퍼센트 PFA에 20 분 다시 수정.
- RT에서 PBST로 5 분 각각 두 번 씻으십시오.
3. PREHYBRIDIZATION
- 65 º C에서 5 분 동안 태아를 품어 HYB -.
- HYB에 최소한 1 시간 동안 65 º C에서 Prehybridize +.
4. 이종 교잡
- 제외한 모든 preHYB 50 μl를 제거하지만, 완전히 빠져들 배아를 보관해야합니다.
- 부드럽게 튜브 flicking하여 배아와 혼합 각 riboprobe 1-2 μl (digoxygenin 및 플루오레신 - 레이블 riboprobes)를 추가합니다. 프로브의 양은 일반적으로 20μl 프로브 합성 반응에서 1 2μl입니다.
- 플루오레신가 빛을 민감한 것을 감안할 때, 튜브는 알루미늄 호일에 싸서 또는 기타이 시점에서 최소한의 빛에 노출되어야합니다.
- 65 º C.에서 하룻밤 배아를 품어
5. 프로브 제거
참고이 시점 전달 부족 세제의 솔루션을 제공합니다. 세제의 제거는 얼룩 반응을 도와 나타나지만 배아는 오히려 끈적이 될 원인 않습니다.
- riboprobe를 제거합니다.
- 50 % formamide/2xSSC 65 º C에서 2 X 30 분 씻으십시오.
- 2 X SSC 65 º C에서 15 분 동안 씻으십시오.
- 0.2 X SSC 65 º C 30 분 씻으십시오.
6. 안티 플루오레신 항체 보육
- 1X maleic 산성 버퍼 플러스 2% 차단 시약 (시약의 표 참조)의 솔루션을 500μl의 RT 적어도 1 시간 차단합니다.
- 차단 솔루션의 1:500 희석에로 로체가 제공하는 안티 - 플루오레신 - POD 항체를, 추가합니다.
- 4 º C.에 밤새 품어 이 부화하는 동안, 우리는 측면에 microcentrifuge 관하다.
- 1X maleic 산성 버퍼 4 X 20 분 씻으십시오. 오분 PBS에서 각각에 대해 두 번 씻으십시오.
7. 플루오레신 - LABELLED 프로브 탐지
- TSA 플러스 플루오레신 솔루션 30-60분을 품어. (반응하십시오. 얼룩 솔루션을하기 전에 TSA 기판 스핀 다운 tyramide 시약에게 퍼어킨 엘머 증폭 희석제 버퍼에 1시 50분을 희석.)이 부화하는 동안, 우리는 측면에 microcentrifuge 관하다. 반응 시간은 각 프로브에 대해 경험적으로 결정되어야합니다. 불행히도, 얼룩 반응은 기판이 형광 그대로 시각적으로 모니터링할 수 없으며, 하나는 얼룩 반응에 걸쳐 유비 쿼터스 녹색 형광을 볼 수 있습니다.
- 30 %, 50 %, 75 % 및 PBS의 100 % 메탄올 10 분만에 각 씻으십시오.
- 첫 번째 퍼옥시데이즈를 inactivate 30 분 메탄올에 1% H 2의 해결책 0 2에서 품어.
- 75 % 50 % PBS에 30 % 메탄올 10 분만에 각 씻으십시오. 다음 십분 PBS에서 각각에 대해 두 번 씻는다. 그것은 중요하다는 것을 충족의 모든hanol이 제거됩니다.
TYRAMIDE 신호 증폭주의 사항 :
우리는 퍼어킨 엘머 TSA 키트를 사용하여왔다. 우리는 알렉사 - Tyramide 기판은 퍼어킨 엘머 증폭 희석제 버퍼를 사용하여 잘 얼룩 발견하지만, 우리는 Invitrogen / 분자 프로브 키트와 함께 제공되는 얼룩 버퍼를 사용하여 성공을 없었어요. 마지막으로, 우리는 플루오레신와 알렉사 - 647은 영향을받지있는 동안 Cy5 형광이 이후 메탄올 / H 2 O 2 치료에 의해 제거 것으로 나타났습니다. Cy3 또한 부정적인 그것이 구조적으로 관련되어 Cy5로 메탄올 / H 2 O 2 치료에 의해 영향을받을 수 있습니다. 이러한 이유로, Cy3과 Cy5 TSA 반응은 현장 프로토콜에서 두 형광의 두 번째 얼룩 반응을 위해 사용해야합니다.
8. 안티 Digoxygenin 항체 인큐베이션
- 1X maleic 산성 버퍼 플러스 2% 차단 시약의 용액에 RT 적어도 1 시간 동안 다시 배아를 차단합니다.
- 위의 솔루션을 차단에서 1:1000 희석에 로체 제공한으로 방지 발굴 POD 항체 추가
- 4 º C.에 밤새 품어 이 부화하는 동안, 우리는 측면에 microcentrifuge 관하다.
- 1X maleic 산성 버퍼 4 X 20 분 씻으십시오. 오분 PBS에서 각각에 대해 두 번 씻으십시오.
9. Digoxygenin - LABELLED 프로브 탐지
- (얼룩 솔루션을하기 전에 TSA 기판 스핀 다운. 반응의 경우, 증폭 희석제 버퍼에 tyramide 시약 1시 50분을 희석) TSA에 30~60분 플러스 Cy5 솔루션을 품어이 부화하는 동안, 우리는 측면에 microcentrifuge 관하다. 반응 시간은 각 프로브에 대해 경험적으로 결정되어야합니다.
- 십분 PBST 각 세 번 씻으십시오.
10. PROPIDIUM의 요오드화물 얼룩
- 오분 2 X SSC에 각각에 대해 두 번 씻으십시오.
- 37 30 분 배아를 품어 ° 10 μl RNAse (100μg/ml의 최종 농도에 대한)과 함께 50 μl 2 X SSCT에서 C.
- 삼분 RT에서 2 X SSC에 각 6 번 씻으십시오.
- 2 X SSC에 330μg/ml propidium 요오드화물의의 솔루션에 8 분 동안 배아를 얼룩.
- 삼분 RT에서 2 X SSC에 각 6 번 씻으십시오.
- RT에서 PBS에 4퍼센트 PFA에 20 분 수정.
- RT에서 PBST로 5 분 각각 두 번 씻으십시오.
11. 설치
- 십분 25% 각과 PBST에 50 % 글리세롤을위한 배아를 품어. 4 º C.에 75 % 글리세롤에서 하룻밤 지우기
- 우리는 해부하다와 deyolk 배아과 평면 현미경 슬라이드에 그들을 탑재합니다. 난황은 상당한 배경 형광을 생성할 수 있습니다. 절개는 배아가 gylcerol에 ovenight 해제 후 훨씬 쉽습니다.
솔루션 :
| PBST | PBS 플러스 0.1 % 트윈 | |
| SSCT | SSC 플러스 0.1 % 트윈 | |
| HYB - | 50 % 포름 아미드 5xSSC 0.1 % 트윈 - 20 | |
| HYB + | HYB - 5mg/ml torula (효모) RNA 50μg/ml 헤파린 | torula RNA는 RNA로의 proteinase K의 소화에 의해 준비가되어 이후 페놀 -, 페놀 - 클로로포름 - 및 클로로포름 - extraction.The RNA가 시켰던 및 DEPC - 처리된 물속에 녹아있다. |
| 1 X maleic 산성 버퍼 | 150mM maleic 산, 100mM NaCl (산도 7.5) |
그림 1. 원위치 하이브리드화의 전체 마운트 대표 결과가 이중 형광. (AC). 이미지는 10 - 체절 단계에서 zebrafish 배아의 후부 지역을 통해 하나의 공촛점 섹션을 표시합니다. 보기 맨 앞쪽에와 지느러미입니다. propidium 요오드화물의와 핵의 얼룩진 색 파란색입니다. (A) deltaC의 mRNA는 digoxygenin - 표시 riboprobe 및 TSA - Cy5 시약을 사용하여 검색했습니다. (B) her1 유전자의 mRNA 베꼈는데 것은 플루오레신 - 표시 riboprobe 및 TSA - 플루오레신 시약과 함께 발견되었다. (C) 녹색과 적색 채널을 병합하면 unambiguously 두 유전자의 서로 다른 또는 중복 유전자의 표현의 영역을 식별합니다. (D, E) her1 표현의 상세는이 절차의 높은 해상도를 보여주는. mRNA의 Subcellular 지방화 명확하게 분별 수 있습니다. 화살촉은 핵에 얼룩의 점에 의해 밝혀 적극적인 전송을 전시 세포를 나타냅니다. 화살표는 mRNA의 세포질 지방화를 보여주는 세포를 나타냅니다. her1 및 deltaC에 대한 (F, G) 더블 얼룩이 두 유전자 (흰색 화살촉) 또는 별도로 유전자 (빨간색과 녹색 화살촉) 중 하나를 해독 아르 세포를 보여줍니다.
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Acknowledgments
우리는이 프로토콜을 개발 Dörthe Jülich, 제니퍼 라운드와 앤드류 마라의 기여를 인정하고 싶습니다. NICHD, 미국의 암 사회와 천의 월에서 제공하는 연구 지원합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C |
| Proteinase K, recombinant PCR grade | Roche Group | 03115879001 | Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C |
| Blocking Reagent | Roche Group | 11096176001 | Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws. |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche Group | 11426346910 | Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C. |
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche Group | 11207739910 | As above. |
| TSA Plus Fluorescein system | PerkinElmer, Inc. | NEL741001KT | Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C. |
| TSA Plus Cyanine5 system | PerkinElmer, Inc. | NEL745001KT | As above |
| TSA Plus Cyanine3 system | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT | As above |
| TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG) | Molecular Probes, Life Technologies | T20926 | Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C. |
| RNase, DNase free | Roche Group | 11119915001 | Supplied as 500μg/ml solution |
| Propidium Iodide | Molecular Probes, Life Technologies | P-3566 | Supplied as 1mg/ml solution in water. |
References
- Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
- Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23, 345-358 (2001).
- Jülich, D. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
- Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC. Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).
- Lecuyer, E. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
