Summary
הר שלמים הכלאה באתרו היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר בביולוגיה התפתחותית. כאן, אנו מציגים ברזולוציה גבוהה פלורסנט כפול פרוטוקול הכלאה באתרו לניתוח דפוס הביטוי המדויק של גן יחיד לקביעת חפיפה של תחומים הביטוי של שני גנים. אנו כוללים propidium גרעיני יודיד נגד כתם להדגיש ארגון רקמות.
Abstract
שלמה הר
Protocol
1. קיבעון
- תקן עוברים לילה ב 4 ° C עם paraformaldehyde 4% (PFA) ב-PBS.
- הסר לתקן ולשטוף 2 x PBS, 5 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר (RT).
- עוברים dechorionate ידני PBS בצלחת זכוכית דיכאון באמצעות מלקחיים שען. לאחר dechorionation, העוברים מועברים באמצעות אש זכוכית מלוטשת פיפטה פסטר כיוון שהם עלולים לדבוק pipettes פוליפרופילן.
- העברת עוברים דרך סדרה של 25%, 50% מתנול 75% PBS במשך 5 דקות כל אחד.
- החלפת נוזל עם 100% מתנול, דגירה 5 דקות ולאחר מכן להחליף עם מתנול טריים.
- מקום בו עוברים -20 ° C למשך תקופה מינימלית של שעה אחת. (אנחנו בדרך כלל לדגור העוברים בין לילה. רגיל ב הכלאה באתרו יעבוד על עוברי מאוחסן במשך יותר משנה, אבל אנחנו לא בחנו אם ברזולוציה גבוהה של ניאון הכלאה באתרו הוא איבד ידי אחסון ממושך.)
- לשטוף עוברים במשך 5 דקות כל אחד 75%, 50% מתנול 25% PBST ב RT. לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל אחד PBST ב RT.
- תקן שוב למשך 20 דקות ב PFA 4% PBS ב RT.
- לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל אחד PBST ב RT.
הערה לגבי PFA:
אנו מאחסנים PFA 4% aliquots ב -20 º C (ראה טבלה של ריאגנטים). עבור קיבעון הראשוני, אנחנו רק להשתמש PFA שלא הופשר קודם לכן. עבור הקיבועים הבאים, אנו מרבים להשתמש PFA כי הופשר קודם לכן. קיבוע ראשוני נראה קריטי עבור מכתים מוצלחת עם פרוטוקול זה.
2. Proteinase AND POSTFIXATION
- תקציר עם proteinase K (5μg/ml ב PBST) בשעה RT במשך 3 עד 12 דקות כדי permeabilize את העוברים. (זמן הדגירה תלוי בגילו של עוברים כמו שלבים צעירים רגישים יותר. זה גם תלוי אצווה של האנזים.) לקבלת עוברים שלב somitogenesis, אנחנו בדרך כלל permeabilize במשך 3-4 דקות. במהלך הדגירה זה, אנו להניח את שפופרת microcentrifuge על צדו.
- לשטוף בקצרה PBST ולשטוף פעם במשך 5 דקות בתוך PBST.
- תקן שוב למשך 20 דקות ב PFA 4% PBS ב RT.
- לשטוף פעמיים, במשך 5 דקות כל אחד, PBST ב RT.
3. PREHYBRIDIZATION
- דגירה עוברים במשך 5 דקות בטמפרטורה של 65 מעלות ב-HYB.
- Prehybridize ב-C º 65 במשך שעה לפחות 1 ב HYB +.
4. הכלאה
- הסר את כל אבל 50 μl של preHYB, אך הקפד לשמור את העוברים שקוע לחלוטין.
- הוספת 1-2 μl של כל riboprobe (digoxygenin ו והעמסת שכותרתו riboprobes) על ידי עוברי ומערבבים בעדינות מצליף את הצינורית. כמות בדיקה הוא בדרך כלל 1-2μl מ תגובה בדיקה 20μl סינתזה.
- בהתחשב בכך והעמסת הוא רגיש לאור, צינורות יש לעטוף בנייר אלומיניום או אחרת חשוף לאור מינימלי מרגע זה והלאה.
- דגירה עוברים לילה בשעה 65 º C.
5. בדיקה הסרת
ראוי לציין, כי הפתרונות של חומר ניקוי זה חוסר קדימה נקודה. ביעור של חומר ניקוי מופיעה לעזור התגובות מכתים אך גורם העוברים להיות דביק למדי.
- הסר את riboprobe.
- לשטוף 2 x 30 דקות ב-C º 65 ב formamide/2xSSC 50%.
- שטפו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 65 מעלות ב 2 x SSC.
- שטפו במשך 30 דקות 65 מעלות צלזיוס ב 0.2 x SSC.
6. אנטי נוגדנים והעמסת הדגירה
- חסום במשך שעה לפחות 1 ב RT ב 500μl של פתרון של חיץ 1x חומצה maleic בתוספת 2% ריאגנט חוסם (ראה טבלה של ריאגנטים).
- הוסף את הנוגדן אנטי והעמסת-POD, כפי שסופק על ידי חברת רוש, בדילול 1:500 בפתרון חסימה.
- דגירה לילה ב 4 º C. במהלך הדגירה זה, אנו להניח את שפופרת microcentrifuge על צדו.
- שטפי 4 x 20 דקות חיץ 1x חומצה maleic. לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל אחד PBS.
7. זיהוי של בדיקה והעמסת-מדביקים לו תווית של
- דגירה 30-60 דקות פתרון ה-TSA והעמסת פלוס. (ספין למטה המצע TSA לפני קבלת פתרון מכתים. עבור התגובה, לדלל מגיב tyramide 1:50 במאגר פרקין אלמר diluent הגברה.) במהלך הדגירה זה, אנו להניח את שפופרת microcentrifuge על צדו. זמן התגובה צריכה להיקבע באופן אמפירי עבור כל בדיקה. למרבה הצער, התגובה מכתים לא ניתן לנטר חזותית כמו המצע הוא פלורסנט, ואחד יראה פלואורסצנטי ירוק בכל מקום ברחבי התגובה מכתים.
- שטפו במשך 10 דקות כל אחד 30%, 50%, 75% ו 100% מתנול ב PBS.
- דגירה בתמיסה של 1% H 2 0 2 מתנול במשך 30 דקות כדי להשבית peroxidase הראשון.
- שטפי 10 דקות כל אחד 75%, 50% ו - 30% מתנול PBS. לאחר מכן לשטוף פעמיים במשך 10 דקות כל אחד PBS. חשוב שכל נפגשוhanol להסירו.
הערות על הגברה האות TYRAMIDE:
We have been באמצעות פרקין אלמר ערכות ה-TSA. אנו מוצאים כי Alexa-Tyramide מצעים כתם גם באמצעות פרקין אלמר diluent חיץ הגברה, אבל אנחנו לא נחלו הצלחה באמצעות חיץ מכתים מסופק עם ערכות בדיקות Invitrogen / מולקולרית. לבסוף, מצאנו כי Cy5 הקרינה מסולק על ידי טיפול שלאחר מכן מתנול / H 2 O 2 ואילו והעמסת Alexa ו-647 אינם מושפעים. Cy3 עשוי גם להיות מושפע לרעה את הטיפול מתנול / H 2 O 2 כפי שהוא קשור מבנית Cy5. מסיבה זו, Cy3 ו Cy5 תגובות TSA יש להשתמש רק עבור התגובה מכתים השני ניאון כפול פרוטוקול באתרה.
8. אנטי Digoxygenin נוגדן הדגירה
- חסום את העוברים שוב במשך שעה לפחות 1 ב RT בתמיסה של חיץ 1x חומצה maleic בתוספת 2% ריאגנט חוסם.
- הוסף את הנוגדן אנטי DIG POD כפי שסופק על ידי רוש בדילול 1:1000 ב לעיל חסימת פתרון
- דגירה לילה ב 4 º C. במהלך הדגירה זה, אנו להניח את שפופרת microcentrifuge על צדו.
- שטפי 4 x 20 דקות חיץ 1x חומצה maleic. לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל אחד PBS.
9. זיהוי של בדיקה Digoxygenin-מדביקים לו תווית של
- דגירה 30-60 דקות TSA פלוס Cy5 פתרון (ספין למטה המצע TSA לפני קבלת פתרון מכתים. עבור התגובה, לדלל מגיב tyramide 1:50 במאגר diluent הגברה) במהלך הדגירה זה, אנו להניח את שפופרת microcentrifuge על צדו. זמן התגובה צריכה להיקבע באופן אמפירי עבור כל בדיקה.
- לשטוף שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד PBST.
10. PROPIDIUM מכתים יודיד
- לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל 2 x SSC.
- דגירה עוברים במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס 50 μl 2 x SSCT עם 10 RNAse μl (ריכוז סופי של 100μg/ml).
- לשטוף שש פעמים במשך 3 דקות כל אחד 2 x SSC ב RT.
- הכתם עוברים במשך 8 דקות בתמיסה של יודיד propidium 330μg/ml ב 2 x SSC.
- לשטוף שש פעמים במשך 3 דקות כל אחד 2 x SSC ב RT.
- תקן 20 דקות ב PFA 4% PBS ב RT.
- לשטוף פעמיים, במשך 5 דקות כל אחד, PBST ב RT.
11. הרכבה
- דגירה עוברים במשך 10 דקות כל אחד 25% גליצרול ו 50% PBST. נקה לילה גליצרול 75% ב 4 º C.
- אנחנו מחלקים את העוברים ואת deyolk ושטוח הר אותם בשקופית מיקרוסקופ. החלמון יכול לייצר הקרינה רקע משמעותי. Dissection הרבה יותר קל אחרי העוברים ניקית ovenight ב gylcerol.
פתרונות:
| PBST | PBS פלוס 0.1% Tween | |
| SSCT | SSC פלוס 0.1% Tween | |
| HYB- | 50% לפוראמיד 5xSSC 0.1% Tween-20 | |
| HYB + | HYB- 5mg/ml torula (שמרים) RNA 50μg/ml הפרין | RNA torula מוכן ידי עיכול K proteinase של רנ"א עם פנול, לאחר מכן, פנול, כלורופורם, ו כלורופורם extraction.The-RNA הוא זירז ו מומס במים DEPC שטופלו. |
| 1 x חיץ חומצה maleic | 150mm חומצה maleic, NaCl 100mm (pH 7.5) |
באיור 1. תוצאות נציג הר שלם פלורסנט כפול הכלאה באתרה. (AC). תמונות להראות קטע confocal יחיד דרך האזור האחורי של עובר דג הזברה בשלב עשר somite. הנוף הגב עם הקדמי למעלה. מוכתם גרעינים עם יודיד propidium הם בצבע כחול. (א) mRNA deltaC זוהה באמצעות riboprobe digoxygenin שכותרתו ו-TSA Cy5 מגיב. (ב) mRNA עיבד מן הגן her1 זוהה עם riboprobe והעמסת שכותרתו ו-TSA והעמסת מגיב. (ג) תעלות מיזוג ירוק ואדום באופן חד משמעי מזהה אזורים של ביטוי גנים שונים או חופפים של שני גנים. (D, E) פירוט הביטוי her1 הוכחת ברזולוציה גבוהה של הליך זה. לוקליזציה subcellular של mRNA ניתן להבחין בבירור. ראשי חץ להצביע על תא מציג שעתוק פעיל, חשף ידי נקודות של מכתים בגרעין. החצים מצביעים על התא המציג לוקליזציה cytoplasmic של mRNA. (F, G) מכתים פעמיים עבור her1 ו deltaC מגלה התאים לתעתוק שני גנים (חץ לבן), או גן או בנפרד (ראשי חץ אדום וירוק).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המובא כאן עובד היטב עם בדיקות שנותנות איתות חזק נקי לאחר מכתים עבור 30-45 דקות phosphatase בתיווך אלקליין טיפוסי התגובה. לפני ביצוע פלורסנט בפרוטוקול הכלאה באתרו, אנחנו תמיד לבדוק בדיקות שלנו באמצעות פרוטוקול סטנדרטי שאינו ניאון (בתנאי בחומר משלים יחד עם פרוטוקול סינתזה בדיקה). היו לנו פחות הצלחה עם פלורסנט בפרוטוקול הכלאה באתרו כאשר באמצעות בדיקות חלש, אבל זה עשוי להיות אפשרי במקרים מסוימים. יש לנו שילוב בהצלחה ניאון בפרוטוקול הכלאה באתרו עם immunolocalization של β-catenin 3. בעת ביצוע וריאציה זו, אנחנו עושים את HYB-, HYB + ו incubations הכלאה על 55 מעלות צלסיוס במקום 65 מעלות צלזיוס כפי epitopes מופיעים להישמר טוב יותר בטמפרטורה נמוכה יותר. Incubations immunolocalization המבוצעות לאחר התגובות TSA.
מאחר והעמסת שכותרתו בדיקות בדרך כלל חלש יותר בדיקה-digoxygenin שכותרתו עבור אותו הגן, אנחנו בדרך כלל לדמיין את החללית והעמסת שכותרתו הראשון. מקרה אחד שבו אפשר היה רוצה לדמיין את החללית digoxygenin הראשון הוא אם אחד משני הגנים מתבטאת ברמה נמוכה. במקרה זה, אחד עושה digoxygenin-riboprobe עבור הגן חלש כתמים על זה קודם כדי למקסם את האות לרעש. שים לב שאם אתה לדמיין השנייה בדיקה והעמסת, אתה לא צריך לדמיין את החללית digoxygenin עם והעמסת TSA כמו נוגדן אנטי והעמסת תכיר TSA את הכתם כמו גם riboprobe והעמסת שכותרתו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ברצוננו להכיר את תרומתם של Dörthe Jülich, ג'ניפר עגול ואנדרו מארה בפיתוח פרוטוקול זה. מחקר תמיכה הניתנים על ידי NICHD, האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן ואת מצעד הפרוטות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C |
| Proteinase K, recombinant PCR grade | Roche Group | 03115879001 | Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C |
| Blocking Reagent | Roche Group | 11096176001 | Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws. |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche Group | 11426346910 | Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C. |
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche Group | 11207739910 | As above. |
| TSA Plus Fluorescein system | PerkinElmer, Inc. | NEL741001KT | Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C. |
| TSA Plus Cyanine5 system | PerkinElmer, Inc. | NEL745001KT | As above |
| TSA Plus Cyanine3 system | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT | As above |
| TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG) | Molecular Probes, Life Technologies | T20926 | Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C. |
| RNase, DNase free | Roche Group | 11119915001 | Supplied as 500μg/ml solution |
| Propidium Iodide | Molecular Probes, Life Technologies | P-3566 | Supplied as 1mg/ml solution in water. |
References
- Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
- Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23, 345-358 (2001).
- Jülich, D. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
- Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC. Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).
- Lecuyer, E. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
