Summary
in situハイブリダイゼーション全体のマウントは、発生生物学で最も広く使用されている技術の一つです。ここで、我々は、単一の遺伝子の正確な発現パターンを解析するためと、二つの遺伝子の発現領域の重なりを判定するためのin situハイブリダイゼーションのプロトコールで二重蛍光の高解像度を示す。我々は、組織の組織を強調するためにカウンター染色核のヨウ化プロピジウムを含む。
Abstract
全体のマウント
Protocol
1。固定
- 一晩4胚℃でPBS中4％パラホルムアルデヒド（PFA）を持つ。を修正
- 削除修正と室温（RT）で2 × PBS、5分ごとに洗う。
- 時計職人の鉗子を使用してガラスのうつ病のプレートにPBSで手動でdechorionate胚。 dechorionationした後、胚は彼らがポリプロピレンのピペットに付着可能性があるため、ファイアーポリッシュガラスパスツールピペットを用いて転送されます。
- 25％、50％と各5分間、PBS中の75％メタノール、一連の胚を移す。
- 新鮮なメタノールで交換して、100％メタノールで液を交換して5分間インキュベートし。
- 一時間の最小値まで-20℃で場所は胚。 （私たちは、通常は一晩胚をインキュベートする。situハイブリダイゼーションの標準1年以上保存されている胚で動作しますが、我々はin situハイブリダイゼーション蛍光灯の高解像度が長期保管によって失われているかどうかを検討していない。）
- 75％、50％、室温でPBSTで25％メタノールで5分間ごとに胚を洗浄してください。室温で5分間PBSTで各2回洗浄する。
- 室温でPBS中4％PFAで20分間再修正。
- 室温で5分間PBSTで各2回洗浄する。
PFAに関する注意：
我々は（試薬の表を参照）-20℃でアリコートで4％PFAを格納する。初期固定のために、我々は以前に解凍されたことがないPFAを使用してください。その後の注視のために、我々は多くの場合、それ以前に解凍されたPFAを使用してください。初期固定は、このプロトコルで成功する染色ために重要であると表示されます。
2。プロテイナーゼとかん流後
- 胚を透過性に3〜12分間室温でプロテイナーゼK（PBSTで5μg/ml）とダイジェスト。 （インキュベーション時間は、若い段階ではより敏感であるため、胚の年齢に依存する。また、酵素のバッチ処理に依存する。）体節形成期胚では、我々は通常、3〜4分のために透過性。このインキュベーションの間、我々は、その側のマイクロ遠心チューブを置く。
- PBSTで簡単にすすぎ、PBSTで5分間一回洗浄。
- 室温でPBS中4％PFAで20分間再修正。
- 室温でPBSTで、各5分間、2回洗浄する。
3。プレハイブリダイゼーション
- で65℃で5分間胚をインキュベートHYB -。
- HYBで少なくとも1時間、65℃でプレハイブリダイゼーション+。
4。ハイブリダイゼーション
- preHYBのすべてが、50μlを削除するが、完全に水没胚を維持することを確認してください。
- 軽くチューブをタッピングし胚と混合する各リボプローブの1〜2μL（ジゴキシゲニン-およびフルオレセイン標識リボプローブ）を追加します。プローブの量は、典型的には20μlのプローブの合成反応から1 -2μlのです。
- フルオレセインが光に敏感であることを考えると、チューブがアルミホイルに包まれたり、そうでなければこれ以降、最小限の光にさらされるべきである。
- 65 º Cで一晩胚をインキュベート
5。プローブの取外し
この時点で前方に不足の洗剤からソリューションがあることに注意してください。洗剤の除去は、染色反応を助けるように見えますが、胚はかなり粘着性になることがありません。
- リボプローブを取り外します。
- 50％のformamide/2xSSCで65℃で2 × 30分間洗浄します。
- 2 × SSCで65℃で15分間洗浄する。
- 0.2 × SSCで65℃30分間洗浄する。
6。抗フルオレセイン抗体のインキュベーション
- ブロッキング試薬1Xマレイン酸緩衝液を加えた2％溶液を500μLで室温にて少なくとも1時間ブロック（試薬の表を参照）。
- ブロッキング溶液で1:500に希釈したとしてロシュから提供される抗フルオレセイン- POD抗体を、追加します。
- 4℃で一晩インキュベートするこのインキュベーションの間、我々は、その側のマイクロ遠心チューブを置く。
- 1Xマレイン酸緩衝液で4 × 20分間洗浄します。 PBSで2回（各5分間）洗浄する。
7。フルオレセインラベル付きプローブの検出
- TSA Plusのフルオレセイン溶液で30〜60分インキュベートする。 （染色液を作る前に、TSAの基板にスピンダウン。反応は、パーキンエルマーの増幅の希釈バッファーでチラミド試薬1:50に希釈が。）このインキュベーションの間、我々は、マイクロ遠心チューブは横に置く。反応時間は、各プローブに対して経験的に決定する必要があります。残念ながら、染色反応は基質が蛍光であるとして視覚的に監視することができない、と一染色反応を通してユビキタス緑色蛍光が表示されます。
- 30％、50％、75％、PBSで100％メタノールで10分間ずつ洗浄する。
- 第一ペルオキシダーゼを不活性化するために30分間、メタノールで1％の溶液H 2 0 2でインキュベートする。
- 10分各75％、50％、PBSで30％のメタノールを洗ってください。その後、PBSで10分間ずつ2回洗浄する。 METのそのすべてが重要です。hanolは削除される。
チラミドシグナル増幅についての注意：
我々は、パーキンエルマーTSAキットを使用している。我々はAlexa -チラミド基質がパーキンエルマーの増幅の希釈バッファーを使用しても汚れがわかりますが、我々はInvitrogen社/ Molecular Probes社のキットに付属の染色バッファーを使用して成功を収めていない。最後に、我々は、フルオレセインとAlexa - 647は影響を受けないままCy5蛍光は、その後のメタノール/ H 2 O 2処理によって除去されることを見出した。 Cy3にも悪影響を、それが構造的にCy5標識に関連しているとして、メタノール/ H 2 O 2処理によって影響を受ける可能性があります。このような理由から、Cy3およびCy5 TSA反応は、その場のプロトコルで二重蛍光第二染色反応に使用する必要があります。
8。 ANTI -ジゴキシゲニン抗体インキュベーション
- 1Xマレイン酸緩衝液を加えた2パーセントのブロッキング試薬の溶液に、室温で少なくとも1時間再び胚をブロックします。
- 上記ブロッキング溶液で1:1000希釈でRoche社によって提供された抗DIG POD抗体を追加
- 4℃で一晩インキュベートするこのインキュベーションの間、我々は、その側のマイクロ遠心チューブを置く。
- 1Xマレイン酸緩衝液で4 × 20分間洗浄します。 PBSで2回（各5分間）洗浄する。
9。ジゴキシゲニン-ラベル付きプローブの検出
- このインキュベーションの間にTSAで30〜60分プラスCy5とソリューションを（染色液を作る前に、TSAの基板にスピンダウン。反応は、増幅の希釈バッファーでチラミド試薬1:50に希釈）インキュベート、我々は、マイクロ遠心チューブは横に置く。反応時間は、各プローブに対して経験的に決定する必要があります。
- PBSTで10分間ずつ3回洗浄する。
10。ヨウ化プロピジウム染色
- 2 × SSCで2回（各5分間）洗浄する。
- 37℃で30分間胚をインキュベートします10μlのRNアーゼ（100μg/mlの最終濃度）と50μlの2 × SSCTでC。
- 室温で2 × SSCで3分間ずつ6回洗浄する。
- 2 × SSCで330μg/mlのヨウ化プロピジウムの溶液中で8分間胚を染色。
- 室温で2 × SSCで3分間ずつ6回洗浄する。
- 室温でPBS中4％PFAで20分間固定する。
- 室温でPBSTで、各5分間、2回洗浄する。
11。拭き取り方
- 10分25％それぞれPBSTで50％グリセロールのために胚をインキュベートする。 4℃で75％グリセロール中で一晩クリア
- 我々は、胚および顕微鏡スライド上にマウントフラットを細かく分析し、deyolk。卵黄はかなりのバックグラウンド蛍光を生成することができます。解剖では、胚がgylcerolでovenightをクリアした後にはるかに簡単です。
ソリューション：
| PBST | PBS +0.1％のTween | |
| SSCT | SSC +0.1％のTween | |
| HYB - | 50％のホルムアミド 5xSSC 0.1％のTween - 20 | |
| HYB + | HYB - 5mg/mlトルラ（酵母）RNA 50μg/mlヘパリン | トルラRNAは、その後のフェノール、とRNAのプロテイナーゼK消化によって調製されるフェノール - クロロホルム - 、及びクロロホルム- extraction.The RNAを沈殿させ、DEPC処理水に溶解する。 |
| 1 ×マレイン酸バッファー | 150mmのマレイン酸、100mMの塩化ナトリウム液（pH7.5） |
図1代表的なin situハイブリダイゼーション二重蛍光全体のマウントの結果を。 （AC）。画像は10体節段階で、ゼブラフィッシュ胚の後部領域を介して単一の共焦点セクションを示しています。ビューには、上部に前方と背側です。ヨウ化プロピジウムで染色された核は青色です。 （A）deltaCのmRNAは、ジゴキシゲニン標識リボプローブとTSA - Cy5の試薬 を用いて検出した。 （B）HER1の遺伝子から転写されたmRNAフルオレセイン標識リボプローブとTSA -フルオレセイン試薬で検出された。 （C）緑と赤のチャネルを統合すると、明確に二つの遺伝子の異なるまたは重複する遺伝子発現の領域を識別します。 （D、E）HER1表現の詳細は、この手順の高解像度を実証。 mRNAの細胞内局在を明確に識別できる。矢頭は核内染色のドットによって明らかにアクティブな転写を示す細胞を、示している。矢印は、mRNAの細胞質局在を示す細胞を示している。 （F、G）HER1とdeltaCのための二重染色は、別々に両方の遺伝子（白矢印）、またはいずれかの遺伝子を転写している細胞（赤と緑の矢印）を明らかにする。
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Discussion
ここで紹介するプロトコールは、典型的なアルカリホスファターゼを介した反応で30〜45分のために染色した後、クリーンな強力な信号を与えるプローブでうまく動作します。 in situハイブリダイゼーションのプロトコールで蛍光を実行する前に、我々は常に標準の非蛍光プロトコルを（プローブの合成プロトコルと共に補足資料で提供される）を使用して私たちのプローブをテストします。弱いプローブを使用するときに我々は、in situハイブリダイゼーションのプロトコールで蛍光灯とあまり成功を収めているが、それはいくつかのケースでは可能かもしれない。私たちは正常にβ-カテニン3の免疫局在とin situハイブリダイゼーションのプロトコールで蛍光を組み合わせている。この変化を実行するときに、私たちは行っHYB -、HYB +および55℃のハイブリダイゼーションのインキュベーション° Cではなく、65 ° Cエピトープは、低い温度でよりよい維持される表示される。免疫局在のインキュベーションは、TSAの反応の後に実行されます。
フルオレセイン標識プローブは、同じ遺伝子のジゴキシゲニン標識プローブよりも一般的に弱いので、我々は通常、最初のフルオレセイン標識プローブを可視化する。二つの遺伝子のいずれかが低レベルで発現している場合、1つは、最初のジゴキシゲニンプローブを可視化する可能性の一つのインスタンスがあります。このケースでは、一つは弱い遺伝子とそれが最初のノイズへの信号を最大化するための染色用ジゴキシゲニン-リボプローブを行います。あなたがフルオレセインプローブの時間（秒）を視覚化する場合には、抗フルオレセイン抗体は、TSAは、同様にフルオレセイン標識リボプローブとして染色認識するようにフルオレセインTSAでジゴキシゲニンプローブを視覚化しないように注意してください。
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Acknowledgments
我々は、このプロトコルの開発にDörtheユーリッヒ、ジェニファーラウンドとアンドリューマーラの貢献を感謝したい。 NICHD、米国癌学会とマーチオブダイムスが提供する研究支援。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C |
| Proteinase K, recombinant PCR grade | Roche Group | 03115879001 | Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C |
| Blocking Reagent | Roche Group | 11096176001 | Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws. |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche Group | 11426346910 | Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C. |
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche Group | 11207739910 | As above. |
| TSA Plus Fluorescein system | PerkinElmer, Inc. | NEL741001KT | Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C. |
| TSA Plus Cyanine5 system | PerkinElmer, Inc. | NEL745001KT | As above |
| TSA Plus Cyanine3 system | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT | As above |
| TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG) | Molecular Probes, Life Technologies | T20926 | Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C. |
| RNase, DNase free | Roche Group | 11119915001 | Supplied as 500μg/ml solution |
| Propidium Iodide | Molecular Probes, Life Technologies | P-3566 | Supplied as 1mg/ml solution in water. |
References
- Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
- Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23, 345-358 (2001).
- Jülich, D. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
- Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC. Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).
- Lecuyer, E. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
