Summary
Monter toute l'hybridation in situ est l'une des techniques les plus utilisées en biologie du développement. Ici, nous présentons une haute résolution double fluorescentes dans le protocole de l'hybridation in situ pour analyser le profil d'expression précise d'un seul gène et de déterminer le chevauchement des domaines d'expression de deux gènes. Nous incluons une iodure de propidium nucléaires contre-coloration pour mettre en évidence l'organisation tissulaire.
Abstract
Whole montage
Protocol
1. FIXATION
- Fix embryons nuit à 4 ° C avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans le PBS.
- Retirer fixage et de lavage 2 x PBS, 5 minutes chacun à la température ambiante (RT).
- Embryons manuellement dechorionate en PBS dans une plaque de verre de dépression en utilisant une pince horloger. Après dechorionation, les embryons sont transférés à l'aide d'un incendie poli pipette Pasteur en verre, car ils peuvent coller à Pipettes en polypropylène.
- Transfert des embryons à travers une série de 25%, 50% et 75% de méthanol dans du PBS pendant 5 minutes chacune.
- Remplacer liquide avec du méthanol à 100%, incuber 5 minutes, puis le remplacer par du méthanol frais.
- Placez embryons à -20 ° C pour un minimum d'une heure. (En général, nous incuber les embryons pendant la nuit. Standard d'hybridation in situ travaillera sur des embryons conservés depuis plus d'un an, mais nous n'avons pas examiné si la haute résolution de l'hybridation in situ fluorescente est perdu par un stockage prolongé.)
- Lavez les embryons pendant 5 minutes chacun à 75%, 50%, 25% de méthanol dans du PBST à température ambiante. Laver deux fois pendant 5 minutes chacun dans du PBST à température ambiante.
- Fixer à nouveau pendant 20 minutes dans 4% PFA dans du PBS à température ambiante.
- Laver deux fois pendant 5 minutes chacun dans du PBST à température ambiante.
NOTE RELATIVE PFA:
Nous stockons PFA 4% en aliquots à -20 º C (voir tableau des réactifs). Pour la fixation initiale, nous n'utilisons que des PFA qui n'a jamais été préalablement décongelées. Pour fixations ultérieures, nous utilisons souvent l'IFP qui a déjà été décongelé. La fixation initiale semble être critique pour la coloration réussie avec ce protocole.
2. Protéinase et POSTFIXATION
- Digest avec la protéinase K (5μg/ml en PBST) à température ambiante pendant 3 à 12 minutes à perméabiliser les embryons. (Le temps d'incubation dépend de l'âge des embryons plus jeunes stades sont plus sensibles. Elle dépend aussi du lot d'enzyme.) Pour embryons au stade somitogenèse, nous avons généralement perméabiliser pendant 3-4 minutes. Pendant cette incubation, nous posons les microtube sur le côté.
- Rincer brièvement dans PBST et laver une fois pendant 5 minutes dans du PBST.
- Fixer à nouveau pendant 20 minutes dans 4% PFA dans du PBS à température ambiante.
- Laver deux fois, pendant 5 minutes chacun, dans le PBST à température ambiante.
3. Préhybridation
- Incuber les embryons pendant 5 minutes à 65 º C en HYB-.
- Prehybridize à 65 º C pendant au moins 1 heure dans HYB +.
4. HYBRIDATION
- Retirez tous, mais 50 pi de la preHYB, mais veillez à conserver les embryons complètement submergé.
- Ajouter 1-2 ul de chaque ribosonde (digoxygénine et marquée à la fluorescéine ribosondes) pour les embryons et mélanger délicatement en effleurant le tube. Le montant de la sonde est généralement 1-2μl d'une réaction de synthèse de sonde 20 pi.
- Étant donné que la fluorescéine est sensible à la lumière, les tubes doivent être enveloppés dans du papier aluminium ou autrement exposé à la lumière minimale de ce point vers l'avant.
- Incuber les embryons nuit à 65 º C.
5. Sonde démontable
Notez que les solutions de ce détergent manque point de l'avant. L'élimination de détergent apparaît pour aider les réactions de coloration, mais ne causent des embryons à devenir plutôt collante.
- Retirez la ribosonde.
- Lavez 2 x 30 minutes à 65 º C en formamide/2xSSC 50%.
- Laver pendant 15 minutes à 65 º C en 2 x SSC.
- Laver pendant 30 minutes à 65 ° C dans 0,2 x SSC.
6. INCUBATION anticorps anti-fluorescéine
- Bloc pour au moins 1 heure à température ambiante dans 500μl d'une solution de 1x tampon acide maléique en plus réactif 2% de blocage (voir tableau des réactifs).
- Ajouter l'anticorps anti-fluorescéine-POD, tel que fourni par Roche, à une dilution 1:500 dans la solution de blocage.
- Incuber une nuit à 4 ° C. Pendant cette incubation, nous posons les microtube sur le côté.
- Laver 4 x 20 minutes dans le tampon d'acide maléique 1x. Laver deux fois pendant 5 minutes chacun dans du PBS.
7. DÉTECTION DE SONDE fluorescéine ÉTIQUETÉES
- Incuber 30-60 minutes dans le CST plus fluorescéine solution. (Spin bas substrat TSA avant de faire une solution de coloration. Pour la réaction, diluer réactif tyramide 1:50 dans Perkin Elmer tampon diluant d'amplification.) Pendant cette incubation, nous posons les microtube sur le côté. Le temps de réaction doit être déterminée empiriquement pour chaque sonde. Malheureusement, la réaction de coloration ne peut pas être contrôlé visuellement que le substrat est fluorescent, et on verra omniprésents fluorescence verte à travers la réaction de coloration.
- Laver pendant 10 minutes chacun à 30%, 50%, 75% et 100% de méthanol dans du PBS.
- Incuber dans une solution de 1% de H 2 0 2 dans le méthanol pendant 30 minutes pour inactiver la peroxydase premier.
- Laver 10 minutes chacune à 75%, 50% et 30% de méthanol dans du PBS. Puis laver deux fois pendant 10 minutes chacun dans du PBS. Il est important que tous les a rencontréHanol être enlevé.
NOTES SUR L'amplification du signal tyramide:
Nous avons été en utilisant les kits de Perkin Elmer TSA. Nous constatons que les substrats Alexa-tyramide tache bien en utilisant le tampon d'amplification Perkin Elmer diluant, mais nous n'avons pas eu de succès en utilisant la mémoire tampon de coloration fournie avec les kits sondes Invitrogen / moléculaire. Enfin, nous avons constaté que la fluorescence de Cy5 est éliminée par suite de méthanol / H 2 O 2 traitements pendant la fluorescéine et Alexa-647 ne sont pas affectés. Cy3 peut également être affectée par le méthanol / H 2 O 2 traitement car il est structurellement liée à Cy5. Pour cette raison, Cy3 et Cy5 réactions TSA ne devrait être utilisé pour la réaction de coloration fluorescente dans une seconde double dans le protocole in situ.
8. INCUBATION ANTICORPS ANTI-digoxygénine
- Bloquer les embryons encore pour au moins 1 heure à température ambiante dans une solution de 1x tampon acide maléique majoré de 2% réactif de blocage.
- Ajouter l'anticorps anti-DIG POD tel que fourni par Roche à une dilution 1:1000 dans une solution de blocage ci-dessus
- Incuber une nuit à 4 ° C. Pendant cette incubation, nous posons les microtube sur le côté.
- Laver 4 x 20 minutes dans le tampon d'acide maléique 1x. Laver deux fois pendant 5 minutes chacun dans du PBS.
9. DÉTECTION DE SONDE digoxygénine-ÉTIQUETÉES
- Incuber 30-60 minutes dans le CST plus Cy5 Solution (Spin bas substrat TSA avant de faire une solution de coloration. Pour la réaction, diluer réactif tyramide 1:50 dans le tampon d'amplification de diluant) Pendant cette incubation, nous posons les microtube sur le côté. Le temps de réaction doit être déterminée empiriquement pour chaque sonde.
- Laver trois fois pendant 10 minutes chacun dans du PBST.
10. COLORATION iodure de propidium
- Laver deux fois pendant 5 minutes chacun dans 2 x SSC.
- Incuber embryons pendant 30 minutes à 37 ° C dans 50 ul SSCT 2 x avec 10 pl RNAse (pour une concentration finale de 100μg/ml).
- Laver à six reprises de 3 minutes chacun dans 2 x SSC à température ambiante.
- Tache embryons pendant 8 minutes dans une solution d'iodure de propidium 330μg/ml dans 2 x SSC.
- Laver à six reprises de 3 minutes chacun dans 2 x SSC à température ambiante.
- Fix pendant 20 minutes dans 4% PFA dans du PBS à température ambiante.
- Laver deux fois, pendant 5 minutes chacun, dans le PBST à température ambiante.
11. MONTAGE
- Incuber les embryons pendant 10 minutes chacun à 25% et 50% de glycérol dans le PBST. Effacer une nuit dans du glycérol 75% à 4 º C.
- Nous disséquer et deyolk les embryons et les plats les monter sur une lame de microscope. Le jaune peut produire la fluorescence de fond important. La dissection est beaucoup plus facile après les embryons ont effacé ovenight dans gylcerol.
SOLUTIONS:
| PBST | PBS plus Tween 0,1% | |
| SSCT | SSC ainsi Tween 0,1% | |
| HYB- | 50% de formamide 5xSSC 0,1% de Tween-20 | |
| HYB + | HYB- 5mg/ml torula (levure) ARN 50μg/ml héparine | L'ARN est préparé torula par la protéinase K digestion des ARN avec subséquentes phénol, phénol-chloroforme-, et le chloroforme-extraction.The ARN est précipité et dissous dans l'eau traitée au DEPC. |
| Une mémoire tampon x acide maléique | 150 mM d'acide maléique, 100mm de NaCl (pH 7,5) |
Figure 1. Les résultats représentatifs de l'ensemble du montage à double hybridation in situ fluorescente. (AC). Les images montrent une seule section confocale à travers la région postérieure d'un embryon de poisson zèbre au stade de dix somites. La vue est dorsale antérieure vers le haut. Noyaux colorés avec de l'iodure de propidium sont de couleur bleue. (A) ARNm deltaC été détectée en utilisant une ribosonde digoxygénine-étiquetés et TSA-Cy5 réactif. (B) ARNm transcrit à partir du gène HER1 a été détecté avec une ribosonde marquée à la fluorescéine et TSA-fluorescéine réactif. (C) La fusion des canaux vert et rouge identifie sans ambiguïté de l'expression génique des régions distinctes ou de chevauchement des deux gènes. (D, E) Détail de l'expression HER1 démontrant la haute résolution de cette procédure. Localisation subcellulaire des ARNm peut être clairement discernées. Pointes de flèches indiquent une cellule présentant transcription active, a révélé par des points de coloration dans le noyau. Les flèches indiquent une cellule montrant la localisation cytoplasmique des ARNm. (F, G) pour la double coloration HER1 et deltaC révèle les cellules qui sont à la fois la transcription des gènes (tête de flèche blanche), ou soit des gènes séparément (pointes de flèche rouge et vert).
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Discussion
Le protocole présenté ici fonctionne bien avec des sondes qui donnent un signal propre forte après coloration pendant 30-45 minutes dans une phosphatase alcaline médiée typiques de réaction. Avant de procéder à l'fluorescente protocole d'hybridation in situ, nous examinons toujours nos sondes en utilisant la norme non fluorescent protocole (fourni dans le matériel supplémentaire avec le protocole de synthèse de la sonde). Nous avons eu moins de succès avec les fluorescents protocole d'hybridation in situ en utilisant des sondes les plus faibles, mais il peut être possible dans certains cas. Nous avons réussi à combiner l'fluorescentes dans le protocole hybridation in situ avec des immunolocalisation β-caténine 3. Lorsque vous effectuez cette variation, nous ne l'HYB-, HYB + et les incubations d'hybridation à 55 ° C au lieu de 65 ° C comme les épitopes semblent être mieux conservée à la température inférieure. Les incubations sont réalisées immunolocalisation, après les réactions du CST.
Depuis marquée à la fluorescéine sondes sont généralement plus faibles que digoxygénine une sonde marquée pour le même gène, nous avons l'habitude de visualiser la sonde marquée à la fluorescéine premier. Un des cas où on pourrait vouloir de visualiser la sonde digoxygénine première est si l'un des deux gènes est exprimée à un faible niveau. Dans ce cas, on fait un digoxygénine-ribosonde pour le gène de la faiblesse et les taches pour sa première à maximiser le signal à bruit. Notez que si vous visualisez la deuxième sonde à la fluorescéine, vous ne devriez pas de visualiser la sonde digoxygénine à la fluorescéine TSA que l'anticorps anti-fluorescéine reconnaîtra la TSA tache ainsi que la ribosonde marquée à la fluorescéine.
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Acknowledgments
Nous tenons à souligner la contribution de Dörthe Jülich, Jennifer et Andrew ronde Mara dans le développement de ce protocole. Soutien à la recherche fournis par le NICHD, l'American Cancer Society et le Mars of Dimes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C |
| Proteinase K, recombinant PCR grade | Roche Group | 03115879001 | Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C |
| Blocking Reagent | Roche Group | 11096176001 | Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws. |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche Group | 11426346910 | Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C. |
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche Group | 11207739910 | As above. |
| TSA Plus Fluorescein system | PerkinElmer, Inc. | NEL741001KT | Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C. |
| TSA Plus Cyanine5 system | PerkinElmer, Inc. | NEL745001KT | As above |
| TSA Plus Cyanine3 system | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT | As above |
| TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG) | Molecular Probes, Life Technologies | T20926 | Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C. |
| RNase, DNase free | Roche Group | 11119915001 | Supplied as 500μg/ml solution |
| Propidium Iodide | Molecular Probes, Life Technologies | P-3566 | Supplied as 1mg/ml solution in water. |
References
- Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
- Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23, 345-358 (2001).
- Jülich, D. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
- Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC. Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).
- Lecuyer, E. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
