Summary
Всего монтирования в гибридизация является одним из наиболее широко используемых методов в биологии развития. Здесь мы представляем высоким разрешением двумя люминесцентными на месте протокол гибридизации для анализа точных выражению одного гена и для определения перекрытия выражение доменов двух генов. Мы включаем пропидий йодида ответного ядерного пятно, чтобы выделить ткани организации.
Abstract
Всего горе
Protocol
1. ФИКСАЦИИ
- Fix эмбрионов в течение ночи при 4 ° С с 4% параформальдегида (PFA) в PBS.
- Удалить исправить и мыть 2 х PBS, 5 минут при комнатной температуре (RT).
- Вручную dechorionate эмбрионов в PBS в стеклянную пластинку депрессии использованием часовщик пинцетом. После dechorionation, эмбрионы, переданные с помощью пожарной полированное стекло пипетки Пастера, как они могут прилипнуть к полипропилена пипеток.
- Передача эмбрионы через серию 25%, 50% и 75% метанола в PBS в течение 5 минут каждый.
- Замените жидкость со 100% метанола, инкубировать 5 минут, а затем заменить свежим метанолом.
- Место эмбрионов при температуре -20 ° С в течение минимум одного часа. (Как правило, мы инкубации эмбрионы в одночасье. Стандарт в гибридизация будет работать на эмбрионы хранятся в течение более чем года, но мы еще не исследовали, является ли высоким разрешением флуоресцентные в гибридизация теряется при длительном хранении.)
- Вымойте эмбрионов в течение 5 минут каждый на 75%, 50%, 25% метанола в PBST при комнатной температуре. Мыть два раза в течение 5 минут каждый в PBST при комнатной температуре.
- Fix снова в течение 20 минут в 4% PFA в PBS при комнатной температуре.
- Мыть два раза в течение 5 минут каждый в PBST при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНО PFA:
Мы храним 4% PFA в аликвоты при -20 º C (см. таблицу реагентов). Для начальной фиксации, мы используем только PFA, что никогда не было ранее талой. Для последующих записей, мы часто используем PFA, который был ранее талой. Начальная фиксация, кажется, решающее значение для успешного окрашивания с этим протоколом.
2. Протеиназы И вторичная фиксация
- Дайджест с протеиназы К (5μg/ml в PBST) при комнатной температуре в течение от 3 до 12 минут permeabilize эмбрионов. (Инкубационного периода зависит от возраста эмбрионов в качестве младшего этапов более чувствительны. Это также зависит от партии фермента.) Для эмбрионов сомитогенеза этапе мы обычно permeabilize течение 3-4 минут. Во время этой инкубации, мы закладываем микроцентрифужных трубки на ее стороне.
- Промыть кратко в PBST и мыть один раз в течение 5 минут в PBST.
- Fix снова в течение 20 минут в 4% PFA в PBS при комнатной температуре.
- Промыть два раза, в течение 5 минут каждая, в PBST при комнатной температуре.
3. PREHYBRIDIZATION
- Инкубируйте эмбрионов в течение 5 минут при 65 ° С в HYB-.
- Prehybridize при температуре 65 ° С в течение не менее 1 часа в HYB +.
4. ГИБРИДИЗАЦИЯ
- Удалите все, кроме 50 мкл preHYB, но убедитесь, что держать эмбрионов полностью погружены.
- Добавьте 1-2 мкл каждого riboprobe (digoxygenin и меченных флуоресцеином riboprobes) для эмбрионов и смешать, аккуратно стряхивая трубки. Количество зонд, как правило, 1-2μl от 20 мкл реакции синтеза зонда.
- Учитывая, что флуоресцеина является светочувствительным, трубы должны быть завернуты в алюминиевую фольгу или иначе подвергается минимальным свет от данного момента.
- Инкубируйте эмбрионов в течение ночи при 65 ° C.
5. Отсоединения зонда
Обратите внимание, что решения с этого момента моющих средств не хватает. Ликвидация моющего средства, чтобы помочь появляется окрашивание реакции, но вызывает эмбрионов, чтобы стать довольно липким.
- Удалить riboprobe.
- Вымойте 2 х 30 минут при 65 ° С в 50% formamide/2xSSC.
- Промыть в течение 15 минут при 65 ° С в 2 х SSC.
- Промыть в течение 30 минут 65 ° C в 0,2 х SSC.
6. АНТИ-флуоресцеина антитела ИНКУБАЦИИ
- Блок, по крайней мере 1 час при комнатной температуре в 500 мкл раствора 1x малеиновой кислоты буфера плюс 2% блокирующий реагент (см. таблицу реагентов).
- Добавить анти-флуоресцеин-POD антитела, поставляемый компанией Рош, в разведении 1:500 в блокировании решения.
- Инкубируйте течение ночи при 4 ° С. Во время этой инкубации, мы закладываем микроцентрифужных трубки на ее стороне.
- Промыть 4 х 20 минут в 1x малеиновой кислоты буфера. Мыть два раза в течение 5 минут каждый в PBS.
7. ОБНАРУЖЕНИЕ флуоресцеином Меченые PROBE
- Выдержите 30-60 минут в TSA Решение Плюс флуоресцеина. (Spin вниз подложки TSA прежде, чем сделать окрашивание раствора. Для реакции, развести tyramide реагента 1:50 в Perkin Elmer буфера разбавителя усиления.) Во время этой инкубации, мы закладываем микроцентрифужных трубки на ее стороне. Время реакции должна определяться эмпирически для каждого зонда. К сожалению, окрашивание реакция не может быть визуально контролировать как субстрат люминесцентные, и не увидит вездесущий зеленая флуоресценция всей окрашивание реакции.
- Промыть в течение 10 минут каждый в 30%, 50%, 75% и 100% метанола в PBS.
- Инкубируйте в 1% раствора Н 2 0 2 в метаноле в течение 30 минут для инактивации первого пероксидазы.
- Вымойте 10 минут в 75%, 50% и 30% метанола в PBS. Затем промыть два раза по 10 минут каждый в PBS. Важно, чтобы все встретилисьhanol быть удалены.
ЗАМЕТКИ О TYRAMIDE усиления сигнала:
Мы используем Перкин Элмер TSA Kits. Мы считаем, что Alexa-Tyramide субстратов хорошо окрашиваются использованием усиления Перкин Элмер разбавителя буфер, но у нас не было успеха, используя окрашивание буфера снабжена Invitrogen / Molecular Probes Kits. Наконец, мы обнаружили, что Cy5 флуоресценции устраняется последующим метанол / H 2 O 2 в то время как лечение флуоресцеина и Alexa-647 не изменяются. Cy3 также может оказать негативное воздействие на метанол / H 2 O 2 лечения, как это структурно связаны с Cy5. По этой причине, Cy3 и Cy5 TSA реакции должны использоваться только для второй реакции окрашивания в двумя люминесцентными на месте протокол.
8. АНТИ-Digoxygenin антитела ИНКУБАЦИИ
- Блок эмбрионы снова, по крайней мере 1 час при комнатной температуре в растворе 1x малеиновой кислоты буфера плюс 2% блокирующий реагент.
- Добавить анти-DIG POD антител при поставке компанией Рош в разведении 1:1000 в выше блокирующий раствор
- Инкубируйте течение ночи при 4 ° С. Во время этой инкубации, мы закладываем микроцентрифужных трубки на ее стороне.
- Промыть 4 х 20 минут в 1x малеиновой кислоты буфера. Мыть два раза в течение 5 минут каждый в PBS.
9. ОБНАРУЖЕНИЕ Digoxygenin-Меченые PROBE
- Выдержите 30-60 минут в TSA Плюс Cy5 Решение (Spin вниз подложки TSA, прежде чем окрашивание раствора. Для реакции, развести tyramide реагента 1:50 в усилении буфера разбавителя) Во время этой инкубации, мы закладываем микроцентрифужных трубки на ее стороне. Время реакции должна определяться эмпирически для каждого зонда.
- Вымойте три раза в течение 10 минут каждый в PBST.
10. Пропидия йодидом окрашивание
- Мыть два раза в течение 5 минут в 2 х SSC.
- Инкубируйте эмбрионов в течение 30 минут при 37 ° С в 50 мкл 2 х SSCT по 10 мкл РНКазы (для конечной концентрации 100μg/ml).
- Вымойте шесть раз в течение 3 минут каждый в 2 х SSC при комнатной температуре.
- Пятно эмбрионов в течение 8 минут в растворе йодида 330μg/ml пропидий в 2-х SSC.
- Вымойте шесть раз в течение 3 минут каждый в 2 х SSC при комнатной температуре.
- Fix течение 20 минут в 4% PFA в PBS при комнатной температуре.
- Промыть два раза, в течение 5 минут каждая, в PBST при комнатной температуре.
11. МОНТАЖ
- Инкубируйте эмбрионов в течение 10 минут каждый по 25% и 50% глицерина в PBST. Очистить ночь в 75% глицерине при 4 ° С.
- Мы проанализируем и deyolk эмбрионов и плоские смонтировать их на предметное стекло. Желток может привести к значительным флуоресценции фон. Препарирование намного легче после эмбрионов очистили ночъ в gylcerol.
РЕШЕНИЯ:
| PBST | ФСБ, содержащего 0,1% Твин | |
| SSCT | SSC плюс 0,1% Твин | |
| HYB- | 50% формамида 5xSSC 0,1% Твин-20 | |
| HYB + | HYB- 5mg/ml torula (дрожжи) РНК 50μg/ml гепарин | Torula РНК подготовленный протеиназы К пищеварения РНК с последующей фенол-, фенол-хлороформ-и хлороформ-extraction.The РНК осаждается и растворяют в DEPC обработанной воды. |
| 1 х малеиновой кислоты буфер | 150 мМ малеиновой кислоты, 100 мм NaCl (рН 7,5) |
Рисунок 1. Представителю результаты целом крепление двумя люминесцентными на месте гибридизации. (AC). Изображения показывают одно конфокальной сечение задней части полосатого данио эмбриона на десять сомитов. Зрения спинной с передней к вершине. Ядер окрашенных йодистым пропидий окрашены в синий цвет. (А) deltaC мРНК, обнаруженных с применением digoxygenin меченных riboprobe и TSA-Cy5 реагента. (B) мРНК расшифрованы с геном her1 был обнаружен с флуоресцеина меченных riboprobe и TSA-флуоресцеина реагента. (C) Объединение зеленого и красного каналов однозначно идентифицирует отдельных регионах или перекрывающихся генов из двух генов. (D, E) Деталь her1 выражении демонстрирует высокое разрешение этой процедуры. Субклеточных локализации мРНК можно четко различить. Стрелки указывают на ячейки выставке активной транскрипции, выявленные точки окрашивания в ядре. Стрелки указывают ячейка показывает цитоплазматической локализации мРНК. (F, G) Дважды окрашивание на her1 и deltaC показывает, клетки, которые расшифровки обоих генов (белые стрелки), либо гена или отдельно (красные и зеленые стрелки).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, представленные здесь хорошо работает с зондов, которые дают чистый сильный сигнал после окрашивания в течение 30-45 минут в обычной щелочной фосфатазы-опосредованной реакции. Перед выполнением флуоресцентные на месте протокол гибридизации, мы всегда проверяем наши зонды используя стандартный без флуоресцентного протокола (при условии, в дополнительный материал вместе с протоколом синтеза зонда). Мы имели меньший успех с люминесцентными на месте протокол гибридизации при использовании зондов слабее, но это может быть возможным в некоторых случаях. Мы удачно сочетаются флуоресцентные на месте протокол гибридизации с immunolocalization из β-катенина 3. При выполнении этих изменений, мы HYB-, HYB + и гибридизации инкубации при температуре 55 ° С вместо 65 ° С, как эпитопов-видимому, сохраняется лучше в более низкой температуре. Immunolocalization инкубации проводятся после реакции АСП.
С флуоресцеин-меченых зондов, как правило, слабее, чем digoxygenin меченного зонда для того же гена, мы обычно себе флуоресцеин-меченым зондом в первую очередь. Один случай, когда можно было бы нужно визуализировать digoxygenin зонд первых, если один из двух генов выражается в низком уровне. В этом случае, один делает digoxygenin-riboprobe для слабых генов и пятен для него первым максимального сигнала к шуму. Заметим, что если вы представляете вторую флуоресцеина зонд, вы не должны визуализировать digoxygenin зонд с флуоресцеина TSA, как анти-флуоресцеин антитела узнают TSA пятна, а также меченных флуоресцеином riboprobe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы хотели бы отметить вклад Dorthe Юлих, Дженнифер Круглый и Андрей Мара в разработке этого протокола. Исследования поддержки со стороны NICHD, Американского онкологического общества и марте Dimes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C |
| Proteinase K, recombinant PCR grade | Roche Group | 03115879001 | Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C |
| Blocking Reagent | Roche Group | 11096176001 | Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws. |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche Group | 11426346910 | Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C. |
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche Group | 11207739910 | As above. |
| TSA Plus Fluorescein system | PerkinElmer, Inc. | NEL741001KT | Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C. |
| TSA Plus Cyanine5 system | PerkinElmer, Inc. | NEL745001KT | As above |
| TSA Plus Cyanine3 system | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT | As above |
| TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG) | Molecular Probes, Life Technologies | T20926 | Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C. |
| RNase, DNase free | Roche Group | 11119915001 | Supplied as 500μg/ml solution |
| Propidium Iodide | Molecular Probes, Life Technologies | P-3566 | Supplied as 1mg/ml solution in water. |
References
- Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
- Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23, 345-358 (2001).
- Jülich, D. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
- Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC. Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).
- Lecuyer, E. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
