Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Gestandaardiseerde Voorbereiding van de Single-celsuspensies van Mouse longweefsel met behulp van de gentleMACS Dissociator

doi: 10.3791/1266 Published: July 2, 2009

Summary

Dissociëren cellen van specifiek weefsel soorten vereist specifieke parameters voor weefsel opwinding tot het verkrijgen van een hoog volume van levensvatbare, kweekbare cellen. De Miltenyi gentleMACS dissociator optimaliseert deze taak met een eenvoudige, praktische protocol. In deze publicatie het gebruik van dit apparaat op longweefsel wordt uitgelegd.

Abstract

De voorbereiding van single-cell schorsingen van weefsel is een belangrijke voorwaarde voor veel experimenten in cellulair onderzoek. Het proces van dissociëren hele organen vereist specifieke parameters om een ​​groot aantal levensvatbare cellen te verkrijgen op een reproduceerbare manier. De gentleMACS Dissociator optimaliseert deze taak met een eenvoudige, praktische protocol. Het instrument bevat voorgeprogrammeerde instellingen die zijn geoptimaliseerd voor het efficiënt, maar zachte dissociatie van een verscheidenheid van weefsels types, inclusief muis longen. In deze publicatie het gebruik van de gentleMACS Dissociator op longweefsel zijn afgeleid van muizen is aangetoond.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Om te werken onder steriele omstandigheden, is het raadzaam om alle stappen in een laminaire stroming kap uit te voeren.

1. Materialen

  1. HEPES buffer: 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl 2)
  2. Collagenase D oplossing: Collagenase D: 100 mg / ml (Collagenase D> 0,15 U / mg), in HEPES buffer
  3. DNase I oplossing: 20.000 U / ml DNase I
  4. PBS buffer bij pH 7,2
  5. PEB buffer: een deel BSA Stock Solution in 20 delen autoMACS spoeloplossing
  6. Tissue: long afgeleid van 6 / 7 weken oude volwassen vrouwelijke BALB / C muizen, vrij van aangrenzende organen.
  7. Optioneel: CD11c microbolletjes, MACS MS Columns, MACS Separator voor de isolatie van dendritische cellen van muizen long single-celsuspensie

2. Dissociatie het longweefsel

  1. Spoel weefsel in een petrischaal met PBS aan erythrocyten te verwijderen.
  2. Overdracht een maximum van 450 mg longweefsel naar een gentleMACS C Tube met 4,9 ml HEPES buffer.
  3. Voeg 100 ul Collagenase D-oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 2 mg / ml Collagenase D.
  4. Voeg 10 uL DNase I-oplossing voor maximaal 150 mg weefsel (uiteindelijke concentratie van 40 U / ml DNase I) of 20 il DNase I voor 150 tot 450 mg longweefsel (uiteindelijke concentratie van 80 U / ml DNase I).
  5. Goed afsluiten van de C metro en bevestig deze op de gentleMACS Dissociator. Dan start je het programma "m_lung_01".
  6. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C met automatische rotatie of handmatig draaien om de 5 minuten.
  7. Keer terug naar de sample gentleMACS Dissociator en start het programma "m_lung_02".

3. Filtratie

  1. Bereid een 50 mL buis voor het verzamelen van cellen gefilterd door het vervangen van de kap met een 70 um mesh cel zeef.
  2. Zodra de tweede gentleMACS programma eindigt, afhankelijk van de verdeling van het monster materiaal in de buis, kunt u kort centrifugeer de buis om het monster materiaal op de bodem van de buis te verzamelen.
  3. Verwijder de cellen door het septum gesloten kap van de C-Tube met behulp van een geschikte 1000 il pipetpunt en toepassen op de cel zeef.
  4. Was de cel zeef met 5 ml HEPES buffer bij RT.
  5. Centrifugeer de cellen een pellet in een 50 ml buis 300xg gedurende 10 minuten.
  6. Zuig het supernatant en resuspendeer de cel pellet in uw gewenste volume van de PEB buffer.

Deel 4: representatieve resultaten:

Figuur 1
Figuur 1. Lung dissociatie met de gentleMACS ™ Dissociator resulteerde in 92% levensvatbare cellen. Dode cellen werden fluorescent gekleurd met propidiumjodide (PI) (rechts dot plot, links dot plot: geen PI kleuring).

Figuur 2
Figuur 2. Dissociatie van de muis longweefsel met behulp van de gentleMACS Dissociator resulteert in een hoog percentage van de levensvatbare leukocyten en endotheelcellen. De afgeleide single-cell suspensies werden gekleurd met CD45-PE en de CD146-FITC of CD31-FITC en geanalyseerd door flowcytometrie.

Figuur 2C
Figuur 3. Single-celsuspensie afgeleid van muizen longweefsel werd gekleurd met CD11c-FITC en Anti-mPDCA-1-APC voor muis CD11c laag m-PDCA-1 + plasmacytoïde DCs evenals CD11c hoge cellen te detecteren.


Figuur 4
Figuur 4. Verrijking van dendritische cellen met behulp van CD11c microbolletjes, een MiniMACS Separator en twee MS kolommen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In deze video, introduceren we een nieuwe methode voor de dissociatie van de muis longweefsel. We laten zien dat een combinatie van mechanische en enzymatische behandeling van het longweefsel een hoog percentage van levensvatbare leukocyten en endotheelcellen opgeleverd. In het bijzonder, was de mechanische desintegratie van het weefsel bereikt door de gentleMACS Dissociator. De gentleMACS C Tubes zijn een rotor - stator systeem, dat scheidt weefsel in een zachte manier. De procedure wordt gecontroleerd door de programma-instellingen van het instrument. De instellingen zijn geoptimaliseerd om een ​​hoge opbrengst en de levensvatbaarheid van de cellen te bereiken. De afgeleide single-cell suspensies werden gekleurd met CD45-PE en de CD146-FITC of CD31-FITC en geanalyseerd door flowcytometrie naar leukocyten en endotheelcellen op te sporen. Dendritische cellen in de single-celsuspensie werden gekleurd met FITC CD11c-en Anti-mPDCA-1-APC. Verder werden dendritische cellen van een muis long single-celsuspensie verrijkt met MACS Technology:. Dendritische cellen werden magnetisch gelabeld met behulp van CD11c microbolletjes en gescheiden met behulp van een MiniMACS Separator en MS Columns 1,2 In het algemeen, de combinatie van onze nieuwe dissociatie protocol met magnetische celsortering is een gestandaardiseerde methode om specifieke celtypen te verkrijgen van longweefsel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

De auteurs zijn medewerkers van Miltenyi Biotec GmbH, Duitsland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C Tubes Miltenyi Biotec Order no. 130-093-237 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
gentleMACS™ Starting Kit Miltenyi Biotec Order no. 130-093-235 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
MACSmix™ Tube Rotator Miltenyi Biotec Order no. 130-090-753 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
autoMACS™ Rinsing Solution Miltenyi Biotec Order no. 130-091-222 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® BSA Stock Solution Miltenyi Biotec Order no. 130-091-376 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
CD11c MicroBeads Miltenyi Biotec Order No. 130-052-001 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx
CD11c-FITC, CD11c-PE Miltenyi Biotec Order no. 130-092-026130-091-830 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_329_CD11c.aspx
Anti-mPDCA-1-APC Miltenyi Biotec Order no. 130-091-963 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx
CD146-FITC Miltenyi Biotec Order no. 130-092-026 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx
CD45-PE Miltenyi Biotec Order no. 130-091-610 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_331_CD45.aspx
Propidium Iodide Solution Miltenyi Biotec Order no. 130-093-233 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx
Art 1000 Reach Pipet Tips Molecular BioProducts Order no. 2079 http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61
http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swanson, K. Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function. J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).
  2. Vermaelen, K., Pauwels, R. Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights. Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).
Gestandaardiseerde Voorbereiding van de Single-celsuspensies van Mouse longweefsel met behulp van de gentleMACS Dissociator
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (29), e1266, doi:10.3791/1266 (2009).More

Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (29), e1266, doi:10.3791/1266 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter