全球基因表达分析，使用斑马鱼的寡核苷酸芯片平台

Summary

基因芯片在基因表达分析的有力工具，在全基因组水平。这项技术已经在各种生物学科包括发育生物学和毒理学中的应用。在这段视频中，我们详细介绍一个使用斑马鱼为一个全面的寡核苷酸芯片平台，全球的基因表达分析的协议。

Abstract

基因芯片技术允许全基因组的基础上的转录水平和基因表达分析的定量测量。基因芯片技术是使用在众多的生物学科中的各种应用，包括全球的发育阶段的基因表达分析，一种疾病状态，并在毒性反应。在此，我们使用一个全面的斑马鱼的特异性寡核苷酸芯片平台的全球基因表达分析演示。斑马鱼的表达微阵列平台包含385000探头，60个碱基对，长度可达12％目标探头的审讯37157目标。对于这个平台上，所有的cDNA和斑马鱼的基因组信息收集各种基因​​组数据库，包括Ensembl（http://www.ensembl.org），天威（http://vega.sanger.ac.uk），加州大学圣克鲁兹分校（ http://genome.ucsc.edu），ZFIN（http://www.zfin.org）。因此，这种表达阵列提供完全覆盖目前斑马鱼的转录。斑马鱼表达微阵列是由罗氏NimbleGen（麦迪逊，威斯康星州）印刷。这种技术示范，包括荧光标记的cDNA产品，杂交标记的cDNA产品的芯片平台，使用一种颜色的分析策略的信号采集和阵列扫描。

Protocol

第1部分：荧光标记的cDNA

Cy3标记的芯片实验中使用的染料是敏感的光降解。该程序应采取少量的光的地方。改编自BioPrime阵列比较基因组杂交基因标记系统手册¹标签协议。

1. 标记反应试剂存放于-20 ° C。从BioPrime阵列比较基因组杂交基因标记系统解冻2.5X随机引物缓冲液，10X dCTP混合，无核酸酶水。此外解冻染料Cy3标记的dCTP。解冻后，所有试剂使用前短暂离心。
2. 一个单独的标记反应将需要为每个基因样本进行分析完成。添加到0.6毫升厚壁管500毫微克的cDNA，40μL的2.5倍随机引物缓冲和无核酸酶水总量达到86μL。
3. 充分混匀，短暂离心。孵育5分钟的反应在100℃热循环仪上一个彗星。
4. 立即转移到10分钟，冰浴浆反应。
5. 每管中，再加入10μL10X dCTP混合，加入2μl1毫米Cy3标记的dCTP和2μL埃克索的Klenow DNA聚合酶。埃克索的Klenow DNA聚合酶应留在冰箱，直到需要，应始终保持在冰上。
6. 混合反应良好，短暂离心。
7. 在37 ° C孵育16小时的热循环反应。

第2部分：标记的cDNA降水

1. 在继续之前，NimbleGen的杂交系统的协议转让系统平衡至42 ° C。
2. 对于每一个反应，放入1.5 ml管中的一个单片机列。加入300μL0.1X SSC的标记反应（100微升）的内容每一列。
3. 离心管列，其中包含10分钟，在16100 XG 4 ° C。
4. 放弃通过的流量，这可能是略带粉色的颜色，和另外300μL0.1X SSC添加到列。
5. 重复离心10分钟，在16100 XG在4 ° C。
6. 丢弃流量通过添加一个额外的300μL0.1X SSC列。
7. 离心12分钟，在16100 XG 4 ° C。
8. 丢弃流量通过。通过流动应该清楚这最后一次洗涤后，你应该可以看到粉红色标记的cDNA列。
9. 100μL无核酸酶水的应用列。删除列从1.5毫升管和翻转到一个新的1.5 ml管的列。
10. 离心2分钟，在2300 XG在4 ° C。标记的cDNA应水化水收集在试管底部。
11. 根据制造商的指示使用一个NanoDrop ND - 1000分光光度计，计算DNA浓度和评估计算基染 ​​料的比例，其中核苷酸Cy3标记的_比例等于₂₆₀ / 550的比例由23.15乘以的染料掺入。基染料的比例应在50和80之间。
12. 如果标有足够的cDNA如果等分6微克的cDNA到一个新的1.5 ml管的标记。
13. 混合在0.1倍体积的3 M NaOAc，pH值5.2 1X体积异丙醇。允许混合物在黑暗中孵育30分钟，在室温下。
14. 下一步离心机16100 XG样品在室温下20分钟。
15. 小心丢弃，而不会干扰DNA沉淀，应在粉红色的上清。
16. 执行加入500μL70％乙醇，轻轻颠倒混合乙醇洗。
17. 离心样品在室温下5分钟XG 16100。
18. 去除上清，逆变管，并允许颗粒干燥5分钟。在这一步沉淀可在-20℃保存° C，如果需要，或该协议可以继续杂交步骤。

第3部分：杂交

杂交过程是改编自罗氏NimbleGen阵列用户指南“的基因表达分析^2。

1. 5μL无核酸酶水溶解沉淀。
2. 一旦沉淀溶解添加表1中所列的杂交组件。杂交组件从罗氏NimbleGen杂交试剂盒。所有组件都添加后总体积现在应该共18μL。拌匀，并简要旋管底部收集的内容。
3. 下一步是变性在95℃放置5分钟热块标记的cDNA。
4. 立即传送管NimbleGen的杂交系统，而数组在以下步骤准备。
5. 微阵列应小心处理和存储根据制造商的指示。罗氏NimbleGen的建议，在黑暗中干燥剂在室温下储存表达阵列。
6. 装入精密混合器调整工具提供的NimbleGen阵列处理配件（PMAT）阵列。
<李>加载到PMAT X1的调音台，用镊子取出胶条。关闭安全PMAT。应用到调音台的压力，并通过在PMAT孔缓缓打开，使阵列和混频器的PMAT脱离。
7. 紧紧申请brayer与周围外部混频器的压力，以确保密封的阵列完成，并删除任何气泡。广场上的杂交系统阵列混合器复杂温暖。
8. 使用位移吸管，慢慢加入15μl标记样品的填充端口。这是在混频器的中心位于孔。应用缓慢而稳定的压力，吸液管，使样品均匀，无任何气泡通过调音台传播。从端口孔擦去多余的样品，并用胶带密封的端口孔。
9. 关闭闩锁并开始使用上的NimbleGen杂交系统解决方案B的杂交混合。允许芯片杂交16-20小时。

第4部分：杂交后的洗涤和微阵列扫描

洗涤和扫描过程是改编自罗氏NimbleGen阵列用户指南²的基因表达分析。

1. 一旦杂交的准备，如表2所列的洗缓冲区已接近完成。预温洗涤缓冲液执行机构至42 ° C水浴中。
2. GenePix 4000B阵列扫描仪打开，让扫描仪在使用前约15分钟的热身。
3. 倒入一盘预热洗涤缓冲液执行机构。
4. 从NimbleGen的杂交系统和幻灯片夹具（提供的NimbleGen阵列处理配件），删除阵列的混频器复杂。浸大会进入预热洗涤缓冲液执行机构，并仔细清除剥落从幻灯片搅拌机。
5. 在洗涤缓冲液执行机构为15秒，取出夹具和鼓动阵列。
6. 快速传输到阵列在室温洗涤缓冲IB的滑动机架。大力幻灯片机架搅拌2分钟。
7. 转移到洗涤缓冲液II幻灯片机架，搅拌1分钟。
8. 转移洗涤缓冲液III和搅拌15秒的幻灯片机架。
9. 阵列转移到干燥的离心机幻灯片和自旋为2分钟，以除去所有水分。继续扫描。
10. 这是建议立即扫描阵列，因为染料是既轻又臭氧敏感。
11. 负载的阵列，条码下来，到GenePix 4000B阵列扫描仪。
12. 打开GenePix Pro软件进行扫描数组。罗氏NimbleGen基因表达阵列，利用一个彩色杂交战略。结果只有一个波长进行扫描。扫描Cy3标记的荧光信号，使用532 nm激光。打开硬件设置对话框，设置的532 nm激光的光电倍增管的价值500的值。
13. 在硬件设置对话框中，设置100％，平均为1至5微米的像素尺寸，线，电源和焦点位置为0微米。
14. 执行预览扫描并设置扫描区域。
15. 执行扫描。
16. 一旦扫描完成后检查图像的直方图。理想的情况下，1E - 5正常化数应在65000〜1-2％的特点是饱和的饱和极限的意义。如果规范化计数小于1E - 5，提高光电倍增管的增益和重新扫描的幻灯片。如果规范化计数大于1E - 5，降低光电倍增管的增益和重新扫描的幻灯片。
17. 一旦扫描完成后保存图像。建议选择在便于参考的图像标准命名公约。图像可以被装载到数据分析程序的数据规范化和强度值计算的偏好。

代表性的成果

开始与0.1X SSC洗时，你可以先开始评估Cy3标记荧光标记的cDNA反应的效率。在其后每洗流过，应该成为粉红色，最后通过明确流。此外，Cy3标记的cDNA产物应列上可见，在这些洗涤步骤。如果通过的流量是在色彩明亮的粉红色，或有没有列上的粉红色产品，这是一个很好的迹象，没有正确地进行标记反应。标记反应可定量使用NanoDrop ND - 1000分光光度计，以确定标记的DNA和基染料的比例（图1）的浓度进行评估。标记反应，经常产生至少10微克标记的DNA，在我们的实验室。染料掺入可以通过使用一个简单的基地/染料比率核苷酸Cy3标记的比例等于₂₆₀ / ₅₅₀的比例由23.15乘以计算。值从50-80不等，表明足够的染料掺入标记反应。如果标记反应产生到话筒低浓度的DNA或较差的染料掺入，样品的杂交roarray不建议应反复标记反应。

可以通过计算图像的直方图和微阵列扫描图像（图2）进行杂交的质量评估。可接受的杂交将有1-2％的饱和特性（即高产1E - 5正常化计数65000饱和极限）近500集的PMT值。如果PMT值进行调整，从500大幅1E - 5正常化数达到65000饱和极限，这通常表示差标记的cDNA微阵列杂交。如果这个数据是继续通过随后的分析将包括数据质量。杂交质量还可以通过查看图像扫描阵列（图3）定性评估。罗氏NimbleGen杂交试剂盒包含对齐寡核苷酸的混合物Cy3标记和Cy5标记的48mer寡核苷酸阵列杂交对齐功能。对齐寡核苷酸的强度的定性评估，以阵列上的其他功能允许到阵列上的荧光标记的cDNA杂交效率的质量检查。经过进一步的分析，分析数据的散点图可以用来确定基因表达的相对水平，并确定您的样品（图4）之间的差异表达基因。

图1。从用Cy3标记的cDNA标记的cDNA产量和染料掺入NanoDrop的频谱可以评估使用NanoDrop ND - 1000分光光度计。请点击这里看到图1的放大版本。

图2。一个GenePix直方图可以扫描芯片杂交质量进行评估，通过评估图像的直方图。可接受的杂交将有1-2％1E - 5正常化计数饱和的PMT值近500 65,000饱和极限的功能。请点击这里看大图图2。

图3。通过查看扫描图像的芯片扫描芯片图像质量进行评估。杂交。应检查图像的存在灰尘或其他的干扰因素，禁止每个功能的可视化，从而防止功能的荧光强度的精确计算。对齐寡核苷酸的强度可以比阵列上的其他功能，以评估杂交效率。

图4。一个散点图分析芯片实验。此过程的目标是要确定，在您的样品的差异表达基因。微阵列数据可以进一步分析和散点图来看，可视化，差异表达基因。

表1。罗氏NimbleGen杂交试剂盒杂交第2步要添加的组件。

组件	卷
样品（溶解于水）	5μL
2X杂交缓冲液	9μL
HYB一个	3.6μL
对齐寡核苷酸	0.4μL
总成交量	18μL

表2。洗净准备以下杂交洗涤阵 ​​列的缓冲区。

组件	洗涤缓冲液IA *	洗涤缓冲液。 B	洗涤缓冲液II	洗涤缓冲液III
水	225毫升	225毫升	225毫升	225毫升
我10X洗涤缓冲液，第二，或第三	25毫升	25毫升	25毫升	25毫升
1中号数码地面电视	25μL	25μL	25μL	25μL
总成交量	250毫升	250毫升	250毫升	250毫升

*预温至42 ° C

Discussion

许多芯片的协议，其中包括一个详细介绍，使用荧光染料，作为测量和量化杂交手段。 Cy3标记的荧光染料，是敏感的照片和臭氧降解。这是建议的程序，在最短的照明进行。此外，细小的灰尘颗粒可以干扰与杂交和扫描。应给予特别关注，以确保工作场所清洁无尘。

有许多替代品的标签协议，在此过程中介绍。建议各种标签协议进行测试，以确定每一个具体的表达微阵列平台的最佳标签程序。这里展示的程序进行了优化，为这个特定的表达阵列印罗氏NimbleGen平台。此外，我们已经找到了详细的标签协议，罗氏NimbleGen阵列用户指南“的工作同样也。应谨慎行事，如果其他表达阵列平台，尤其是从其他制造商，应用此协议，杂交属性在很大程度上是由管辖该平台的印刷方法。

耦合此表达阵列协议，我们的RNA提取和cDNA合成的协议，经常会产生在我们的实验室中重现的高品质基因表达阵列的数据。这是一个对所有表达阵列分析的重要目标，最终的数据质量最终取决于这些初始步骤的质量。比在任何一个这些领先到最后表达阵列分析的步骤最佳的结果，会阻碍最终数据的质量。

本视频信号采集的cDNA荧光标记的程序是独立的实验问题表达阵列分析的标准程序。在哪个方向进行表达阵列数据分析，图像采集后，在很大程度上取决于每个具体的实验。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Array Microcentrifuge Dryer	ISC Bioexpress	C-1303-T
BioPrime Array CGH Genomic Labeling System	Invitrogen	18095-011
Cyanine 3-dCTP	PerkinElmer, Inc.	NEL576
GenePix 4000B	Molecular Devices	GENEPIX 4000B
Microcon YM-30	EMD Millipore	42411
NimbleGen Array Processing Accessories	Roche Group	5223539001
NimbleGen Hybridization Kit	Roche Group	5223474001
NimbleGen Hybridization System 4	Roche Group	5223652001
NimbleGen Wash Buffer Kit	Roche Group	5223504001
X1 Mixers	Roche Group	5223725001