Mondial Analyse expression génique utilisant une plateforme biopuces oligonucléotidiques Zebrafish

Summary

Microarrays Gene sont des outils puissants en matière de profilage d'expression génique au niveau du génome entier. Cette technologie a des applications dans une variété de disciplines biologiques, y compris la biologie du développement et de la toxicologie. Dans cette vidéo, nous détaillons un protocole d'analyse d'expression génique globale à l'aide d'une plateforme complète d'oligonucléotides biopuces pour le poisson zèbre.

Abstract

Gene la technologie des microréseaux permet la mesure quantitative et le profilage d'expression génique des niveaux de transcription sur une base du génome entier. Gene la technologie des puces est utilisée dans de nombreuses disciplines biologiques dans une variété d'applications incluant l'analyse d'expression génique globale par rapport au stade de développement, à un état de maladie, et dans les réponses toxiques. Ici, nous incluons une démonstration de l'analyse de l'expression des gènes en utilisant une échelle mondiale complète zebrafish spécifiques plateforme biopuces oligonucléotides. La plate-forme de poisson zèbre microréseaux d'expression contient 385 000 sondes, 60 paires de base de longueur, interrogeant 37 157 cibles avec jusqu'à 12 sondes par cible. Pour cette plateforme, toutes les informations d'ADNc et génomiques disponibles pour le poisson zèbre ont été recueillies auprès de divers y compris les bases de données génomiques Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC ( http://genome.ucsc.edu), et ZFIN (http://www.zfin.org). En conséquence, cette gamme offre une couverture complète d'expression du transcriptome zèbre actuel. Les microréseaux d'expression poisson zèbre a été imprimé par Roche NimbleGen (Madison, WI). Cette démonstration technique comprend le marquage fluorescent d'un produit d'ADNc, l'hybridation de l'ADNc produit étiqueté à la plateforme biopuces, et la numérisation de tableau pour l'acquisition du signal en utilisant la stratégie d'une couleur d'analyse.

Protocol

Partie 1: marquage fluorescent de l'ADNc Le colorant Cy3 utilisés dans l'expérience microarray est sensible à la photo-dégradation. La procédure devrait avoir lieu en un minimum de lumière. Le protocole de marquage a été adapté à partir du système d'étiquetage CGH array BioPrime génomique manuelle 1. Les réactifs pour la réaction de marquage sont stockés à -20 ° C. De la CGH-array génomique BioPrime système d'étiquetage de dégel 2.5…

Discussion

Protocoles microarray Beaucoup, y compris celui détaillé ici, l'utilisation de colorants fluorescents comme un moyen de mesurer et de quantifier l'hybridation. Le colorant fluorescent Cy3 est sensible à la dégradation de la photo et l'ozone. Il est recommandé que la procédure soit menée dans un minimum d'éclairage. En outre, les petites particules de poussière peuvent interférer avec l'hybridation et la numérisation. Une attention particulière devrait être accordée à s'assurer que …

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Array Microcentrifuge Dryer		ISC Bioexpress	C-1303-T
BioPrime Array CGH Genomic Labeling System		Invitrogen	18095-011
Cyanine 3-dCTP		PerkinElmer	NEL576
GenePix 4000B		Molecular Devices	GENEPIX 4000B
Microcon YM-30		Millipore	42411
NimbleGen Array Processing Accessories		Roche NimbleGen	5223539001
NimbleGen Hybridization Kit		Roche NimbleGen	5223474001
NimbleGen Hybridization System 4		Roche NimbleGen	5223652001
NimbleGen Wash Buffer Kit		Roche NimbleGen	5223504001
X1 Mixers		Roche NimbleGen	5223725001