Gene Expression גלובל ניתוח באמצעות פלטפורמה דג הזברה microarray oligonucleotide

Summary

Microarrays ג'ין הם כלים רבי עוצמה באפיון ביטוי גנים ברמת הגנום כולו. טכנולוגיה זו יישומים במגוון רחב של תחומים לרבות ביולוגי ביולוגיה התפתחותית הרעלים. בסרטון הזה, אנחנו פרט פרוטוקול ניתוח ביטוי גנטי גלובלי באמצעות פלטפורמה מקיפה microarray oligonucleotide על דג הזברה.

Abstract

ג'ין microarray הטכנולוגיה מאפשר מדידה כמותית וביטוי פרופיל גנטי של רמות תמליל על בסיס הגנום כולו. ג'ין microarray הטכנולוגיה משמשת בתחומים ביולוגיים רבים במגוון רחב של יישומים, כולל ניתוח ביטוי גנטי גלובלי ביחס שלב התפתחותי, למצב המחלה, בתגובות רעילים. בזאת, אנו כוללים הדגמה של ניתוח ביטוי גנטי גלובלי באמצעות microarray מקיף דג הזברה ספציפי פלטפורמה oligonucleotide. פלטפורמת microarray דג הזברה הביטוי מכיל 385,000 בדיקות, 60 זוגות בסיסים אורך, לחקור 37,157 יעדים עם עד 12 בדיקות לכל מטרה. עבור פלטפורמה זו, כל מידע ו cDNA גנומי זמין עבור דג הזברה נאסף מתוך מאגרי מידע גנומי שונים, כולל Ensembl (http://www.ensembl.org), וגה (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC ( http://genome.ucsc.edu), ו ZFIN (http://www.zfin.org). כתוצאה מכך זה מערך ביטוי מספק כיסוי מלא של דג הזברה transcriptome הנוכחי. Microarray הביטוי דג הזברה הודפס על ידי רוש NimbleGen (מדיסון, ויסקונסין). זו הפגנה טכני כולל תיוג פלורסנט של מוצר cDNA, הכלאה של המוצר cDNA מסומן לפלטפורמת microarray, וסריקה מערך לרכישת אות אחת באמצעות ניתוח האסטרטגיה צבע.

Protocol

חלק 1: תיוג פלורסנט של cDNA

לצבוע Cy3 השתמשו בניסוי microarray רגיש השפלה, צילום. ההליך צריך להתקיים כמות מינימלית של אור. פרוטוקול תיוג הותאמה ממערכת BioPrime Array CGH הגנום תיוג ידני ^1.

1. ריאגנטים עבור התגובה תיוג מאוחסנים ב -20 ° C. מתוך מערך BioPrime CGH הגנום תיוג מערכת ההפשרה הצפת 2.5x פריימר אקראיים, לערבב dCTP 10X, ו nuclease ללא מים. כמו כן ההפשרה Cy3-dCTP לצבוע. לאחר ההפשרה, בקצרה צנטריפוגות כל ריאגנטים לפני השימוש.
2. תגובה תיוג נפרדת יהיה צורך להשלים עבור כל דגימה cDNA להיות מנותח. לתוך צינור 0.6 עבה חומה מ"ל להוסיף 500 ננוגרם cDNA, 40 הצפת μl 2.5x פריימר אקראיים nuclease ללא מים כדי להשיג בנפח כולל של 86 μl.
3. מערבבים היטב בקצרה צנטריפוגות. דגירה תגובה במשך 5 דקות ב 100 מעלות צלזיוס על thermocycler.
4. מיד עם העברת התגובה slurry לתוך אמבט קרח למשך 10 דקות.
5. כדי צינור אחד ולאחר מכן להוסיף 10 dCTP μl לערבב 10X, 2 μl 1 mM Cy3-dCTP ו 2 μl EXO Klenow פולימראז ה-DNA. פולימראז Klenow exo-DNA יש להשאיר במקפיא עד נחוץ תמיד צריך להיות כל הזמן על הקרח.
6. מערבבים היטב תגובה קצרה צנטריפוגות.
7. דגירה תגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות thermocycler.

חלק 2: משקעים של cDNA תווית

1. לפני המתמשך להפוך את פרוטוקול על מערכת הכלאה NimbleGen ולאפשר למערכת כדי לאזן 42 ° C.
2. עבור כל תגובה, במקום טור Microcon לתוך צינור 1.5 מ"ל. הוסף 300 μl 0.1X SSC כל עמודה ולאחריו את תוכן התגובה תיוג (100 μl).
3. צנטריפוגה הצינור המכיל את הטור ב XG 16,100 במשך 10 דקות ב 4 ° C.
4. מחק את הזרימה דרך, אשר עשוי להיות מעט צבע ורוד, ולהוסיף עוד 300 μl 0.1X SSC לעמודה.
5. חזור צנטריפוגה ב XG 16,100 במשך 10 דקות ב 4 ° C.
6. מחק את הזרימה דרך נוספת להוסיף 300 μl 0.1X SSC לעמודה.
7. צנטריפוגה ב XG 16,100 במשך 12 דקות 4 ° C.
8. בטל לזרום. לזרום צריך להיות ברור אחרי זה לשטוף האחרון אתה אמור להיות מסוגל לראות את cDNA מסומן ורוד על הטור.
9. החל מים 100 μl nuclease ללא לעמודה. הסרת עמודה מהצינור 1.5 מ"ל ו להפוך טור לתוך צינור 1.5 חדש מ"ל.
10. צנטריפוגה XG ב 2300 עבור 2 דקות 4 ° C. CDNA מסומן יש rehydrated במים שאוסף בחלק התחתון של הצינור.
11. השתמש ספקטרופוטומטר NanoDrop ND-1000 על פי הוראות היצרן כדי לחשב את ריכוז ה-DNA ולהעריך שילוב צבע על ידי חישוב בסיס לצבוע יחס שבו נוקלאוטיד יחס Cy3 שווה ₂₆₀ / ₅₅₀ יחס כפול 23.15. בסיס יחס צבע צריך להיות בין 50 ל 80.
12. אם cDNA אם שכותרתו מספיק, 6 מיקרוגרם של aliquot שכותרתו cDNA לתוך צינור 1.5 חדש מ"ל.
13. מערבבים בנפח 0.1X של 3 M NaOAc, pH 5.2 ו 1X נפח isopropanol. אפשר תערובת כדי לדגור בחושך במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
14. הבא צנטריפוגות מדגם XG ב 16,100 במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
15. בזהירות להתעלמות supernatant מבלי להפריע גלולה DNA, אשר אמור להיות בצבע ורוד.
16. בצע לשטוף אתנול על ידי הוספת 500 EtOH 70% μl ומערבבים על ידי היפוך עדין.
17. צנטריפוגה מדגם XG ב 16,100 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
18. הסר את supernatant, להפוך לצינור, ולאפשר גלולה להתייבש במשך 5 דקות. בשלב זה גלולה עשוי להיות מאוחסן ב -20 ° C אם רוצים או פרוטוקול ניתן המשיכו לשלב הכלאה.

חלק 3: הכלאה

ההליך הכלאה מותאמת מדריך NimbleGen רוש מערכים של המשתמש עבור ² ביטוי גנים ניתוח.

1. ממיסים את גלולה ב μl 5 מים nuclease חינם.
2. לאחר גלולה הוא מומס להוסיף רכיבים הכלאה המפורטים בטבלה 1. הרכיבים הם הכלאה של ערכת הכלאה רוש NimbleGen. אחרי כל הרכיבים הוסיף את הנפח הכולל כעת סך 18 μl. מערבבים היטב בקצרה לסובב את הצינור כדי לאסוף את התוכן בתחתית.
3. השלב הבא הוא לפגל cDNA מסומן על ידי הנחת אותו על גוש חום 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
4. מיד להעביר את צינור למערכת הכלאה NimbleGen בעוד מערכים מוכנים בשלבים הבאים.
5. Microarrays צריך תמיד להיות מטופלים בקפידה מאוחסן בהתאם להוראות היצרן. רוש NimbleGen ממליצה מערכי אחסון הביטוי שלהם בחושך עם יבוש בטמפרטורת החדר.
6. טען את מערך לתוך כלי מיקסר יישור Precision (PMAT) הניתנים עיבוד אביזרים מערך NimbleGen.
<li> Load מערבל X1 על PMAT ולהסיר את פס דבק עם מלקחיים. סגור את PMAT מאובטח. החל הלחץ מערבל דרך החור PMAT ולאט לאט לפתוח כך את המערך מערבל להתנתק PMAT.
7. היטב להפעיל לחץ עם ברייר סביב החלק החיצוני של המיקסר על מנת להבטיח את החותם למערך שלם ולהסיר כל הבועות. מניחים את מורכבות מערך מיקסר על המערכת הכלאה לחמם.
8. בעזרת פיפטה עקירה, לאט להוסיף 15 μl של המדגם שכותרתו ליציאת למלא. זהו חור במרכז של המיקסר. החל הלחץ איטית ויציבה כדי פיפטה כך המדגם מתפשט באופן שווה באמצעות מערבל ללא בועות אוויר. תמחקי את כל המדגם עודף החורים הנמל חותם חורים ליציאת עם רצועות דבק.
9. סגור את תפס ולהתחיל ערבוב של הפתרון באמצעות הכלאה B תוכנית על מערכת הכלאה NimbleGen. אפשר microarrays כדי להכליא עבור 16-20 שעות.

חלק 4: פוסט הכלאה מתרחץ סריקה של microarray

ההליך כביסה סריקה מותאמת מדריך NimbleGen רוש מערכים של משתמש עבור ניתוח גנטי הביטוי ^2.

1. לאחר הכלאה קרוב השלמת להכין מאגרים לשטוף כפי שמתואר בטבלה 2. טרום חם הצפת לשטוף IA ל 42 מעלות צלזיוס באמבט מים.
2. הפעל את סורק מערך 4000B GenePix ולאפשר הסורק לחמם כ -15 דקות לפני השימוש.
3. יוצקים את טרום חימם הצפת IA שטפו לתוך צלחת.
4. הסר את מערך מורכב מערבל ממערכת הכלאה NimbleGen והחלק לתוך לנענע (מסופק עיבוד אביזרים מערך NimbleGen). לצלול לתוך הרכבה IA מראש חימם הצפת לשטוף בזהירות להסיר מערבל ידי קילוף משקופית.
5. הסר את מערך מ לנענע ו להתסיס במשך 15 שניות לשטוף הצפת IA.
6. העבר במהירות לתוך מערך מתלה שקופית בטמפרטורת החדר IB לשטוף חוצץ. להתסיס את מתלה להחליק במרץ במשך 2 דקות.
7. העברת מתלה להחליק לתוך לשטוף הצפת השנייה להתסיס במשך דקה 1.
8. העברת מתלה להחליק לתוך III הצפת לשטוף ו להתסיס למשך 15 שניות.
9. העברת מערך לשקופית ייבוש צנטריפוגות ספין 2 דקות כדי להסיר את כל הלחות. המשך סריקה.
10. מומלץ לסרוק את מערך מיד מאחר שהצבע הוא רגיש לאור והן האוזון.
11. טען את הברקוד, מערך למטה, אל תוך הסורק מערך GenePix 4000B.
12. פתח את תוכנת Pro GenePix והמשך סריקה של המערך. NimbleGen ביטוי רוש מערכי גנים לנצל אחד הכלאה אסטרטגיה צבע. כתוצאה מכך אורך גל אחד בלבד נדרש לצורך סריקה. סריקה Cy3 אות הקרינה באמצעות לייזר 532 ננומטר. פתח חומרה ההגדרה בתיבת הדו ולהגדיר ערך PMT של לייזר 532 ננומטר לערך של 500.
13. בתיבת הדו שיח הגדרת חומרה, מערכת החשמל 100%, גודל פיקסל עד 5 מיקרון, קווים הממוצע 1, ו להתמקד בעמדה 0 מיקרון.
14. ביצוע סריקה מקדימה ולהגדיר אזור הסריקה.
15. בצעו סריקה.
16. לאחר הסריקה לבדוק את ההיסטוגרמה התמונה. באופן אידיאלי 1E-5 מונה מנורמל צריך להיות משמעות 65,000 הרוויה להגביל כי ~ 1-2% מהתכונות רוויים. אם ספירת מנורמל פחות מ 1E-5, להגדיל את הרווח PMT והחלק לסרוק מחדש. אם ספירת מנורמל הם יותר 1E-5, להקטין את הרווח PMT והחלק לסרוק מחדש.
17. לאחר הסריקה לשמור את התמונה. מומלץ לבחור מוסכמה למתן שמות סטנדרטיים עבור תמונות כדי להקל על הפניה. התמונה כעת ניתן לטעון לתוכנית ניתוח נתונים של העדפה נורמליזציה נתונים וחישוב של ערכים אינטנסיביות.

נציג תוצאות

אתה יכול הראשונות מתחילות להעריך את היעילות של התגובה Cy3 תיוג הקרינה של cDNA כאשר בתחילת שוטף עם 0.1X SSC. במהלך כל הבאים לשטוף את הזרימה דרך צריך להיות פחות ורוד בצבע עם הזרם שעבר דרך ברורה. בנוסף, Cy3 שכותרתו מוצר cDNA צריך להיות מוצג בעמודה במהלך השלבים לשטוף. אם לזרום הוא ורוד בהיר או בצבע אין מוצר ורוד על הטור, זוהי אינדיקציה טובה כי התגובה תיוג לא נכון להמשיך. התגובה תיוג ניתן להעריך כמותית באמצעות ND-1000 NanoDrop ספקטרופוטומטר כדי לקבוע ריכוז של ה-DNA שכותרתו בסיס יחס צבען (איור 1). התגובה תיוג שגרתי התשואות לפחות 10 מיקרוגרם של ה-DNA שכותרתו במעבדה שלנו. שילוב דיי ניתן לחשב באמצעות היחס פשוט בסיס / צבע שבו נוקלאוטיד יחס Cy3 שווה ₂₆₀ / ₅₅₀ יחס כפול 23.15. ערכים הנעים בין 50-80 עולה ההתאגדות לצבוע מספיק בתגובה תיוג. אם התגובה תיוג התשואות ריכוז נמוך של ה-DNA או שילוב צבע עניים, הכלאה של המדגם על מיקרופוןroarray לא מומלץ והתגובה תיוג יש לחזור.

הערכת האיכות של הכלאה ניתן שנערך על ידי הערכת היסטוגרמה התמונה ואת התמונה הסרוקה של microarray (איור 2). הכלאות מקובל יהיה 1-2% מהתכונות רווי (כלומר, מניב 1E-5 מונה מנורמל בגבול 65,000 את הרוויה) עם ערך PMT להגדיר ליד 500. אם ערך PMT צריך להיות מותאם באופן דרסטי מ - 500 להשיג 1E-5 מונה מנורמל בגבול 65,000 את הרוויה, זה בדרך כלל מצביע על הכלאה העניים של cDNA שכותרתו microarray. איכות נתונים תורכב אם הנתונים המשיכה באמצעות ניתוח שלאחר מכן. איכות הכלאה ניתן להעריך איכותית ידי הצגת תמונות של המערך סרק (איור 3). ערכת NimbleGen רוש הכלאה מכיל תערובת של אוליגו יישור Cy3 ו Cy5 שכותרתו oligonucleotides 48mer כי להכליא את תכונות היישור על מערכים. הערכה איכותית של אינטנסיביות של oligos יישור לתכונות אחרות על המערך מאפשר לבדוק את איכות על יעילות הכלאה של cDNA שכותרתו fluorescently על המערך. בעקבות ניתוח נוסף, העלילה פיזור הנתונים נותחו שלך יכול לשמש כדי לקבוע את רמות היחסי של ביטוי גנים כדי לזהות את הגנים באים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בין הדוגמאות שלך (איור 4).

באיור 1. ספקטרום NanoDrop מן התשואה שכותרתו עם Cy3. CDNA cDNA תווית ושילוב צבע ניתן להעריך באמצעות ND-1000 NanoDrop ספקטרופוטומטר. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.

איור 2. היסטוגרמה GenePix לאיכות microarray. סריקה של הכלאה ניתן להעריך על ידי הערכת היסטוגרמה התמונה. הכלאות מקובל יהיה 1-2% מהתכונות רווי 1E-5 מונה מנורמל בגבול 65,000 את הרוויה עם ערך PMT להגדיר ליד 500. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2.

איור 3. תמונה microarray סרוקות. הכלאה איכות ניתן להעריך על ידי הצגת תמונה סרוקה של microarray. התמונה יש לבחון את קיומו של אבק או גורמים מפריעים אחרים האוסר להדמיה של כל תכונה ובכך, למנוע חישוב מדויק של עוצמת הקרינה של התכונה. העוצמה של oligos יישור אפשר להשוות את התכונות האחרות במערך כדי להעריך את היעילות הכלאה.

איור 4. העלילה פיזור של ניסוי microarray מנותח. מטרת הליך זה היא לזהות את הגנים באים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בדגימות שלך. נתוני microarray ניתן לנתח נוספים שנצפו בעלילה פיזור לדמיין הגנים באים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי.

טבלה 1. רכיבים מן קיט הכלאה NimbleGen רוש להוסיף לשלב הכלאה 2.

רכיב	נפח
לדוגמה (מומס במים)	5 μl
הכלאה 2X הצפת	9 μl
Hyb	3.6 μl
יישור אוליגו	0.4 μl
סך נפח	18 μl

טבלה 2. שטפי מאגרים להיות מוכן כביסה של מערכי בעקבות הכלאה.

רכיב	לשטוף הצפת IA *	לשטוף הצפת IB	לשטוף הצפת II	לשטוף הצפת III
מים	225 מ"ל	225 מ"ל	225 מ"ל	225 מ"ל
10X הצפת לשטוף I, II, III או	25 מ"ל	25 מ"ל	25 מ"ל	25 מ"ל
1 M DTT	25 μl	25 μl	25 μl	25 μl
סך נפח	250 מ"ל	250 מ"ל	250 מ"ל	250 מ"ל

* טרום חמים 42 ° C

Discussion

פרוטוקולים microarray רבים, כולל אחד מפורט כאן, השתמש צבעי ניאון כאמצעי מדידה וכימות הכלאה. לצבוע Cy3 פלורסנט רגיש צילום השפלה האוזון. מומלץ כי הליך להתנהל תאורה מינימלית. בנוסף, חלקיקי אבק קטנים יכול להפריע הכלאה וסריקה. תשומת לב מיוחדת צריכה להינתן על מנת לוודא את אזור העבודה נקי ללא אבק.

ישנן חלופות רבות לפרוטוקול תיוג המתוארים בהליך זה. מומלץ פרוטוקולים שונים תיוג להיבדק כדי לקבוע את ההליך תיוג אופטימלי עבור כל פלטפורמת ביטוי ספציפי microarray. ההליך הפגינו כאן כבר אופטימיזציה עבור פלטפורמה זו מערך ספציפי ביטוי מודפס על ידי רוש NimbleGen. בנוסף, מצאנו את פרוטוקול תיוג מפורט במדריך למשתמש של רוש NimbleGen של מערך לעבוד באותה מידה גם. יש להיזהר אם החלת פרוטוקול אחר מערך פלטפורמות ביטוי, בעיקר של יצרנים אחרים, כמו תכונות הכלאה נשלטים במידה רבה על ידי שיטות הדפסה של הפלטפורמה.

צימוד זה פרוטוקול מערך ביטוי הבידוד שלנו רנ"א פרוטוקול סינתזה cDNA שגרתי תשואות גבוהות לשחזור הגן איכות ביטוי מערך נתונים במעבדה שלנו. זוהי מטרה חשובה עבור כל מנתח מערך ביטוי כי איכות הנתונים הסופיים תלויה בסופו של דבר על איכות השלבים הראשוניים. פחות תוצאות אופטימליות בכל אחת הפעולות שמוביל את הניתוח הביטוי הסופי מערך יהיה לעכב את איכות הנתונים הסופיים.

ההליכים המובאים וידאו זה מן תיוג פלורסנט של cDNA רכישת אות הוא הליך סטנדרטי עבור ניתוח ביטוי מערך עצמאי של שאלת הניסוי. הכיוון שבו להמשיך לניתוח של נתוני מערך הביטוי הבא רכישת התמונה תלויה במידה רבה כל ניסוי ספציפי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Array Microcentrifuge Dryer	ISC Bioexpress	C-1303-T
BioPrime Array CGH Genomic Labeling System	Invitrogen	18095-011
Cyanine 3-dCTP	PerkinElmer, Inc.	NEL576
GenePix 4000B	Molecular Devices	GENEPIX 4000B
Microcon YM-30	EMD Millipore	42411
NimbleGen Array Processing Accessories	Roche Group	5223539001
NimbleGen Hybridization Kit	Roche Group	5223474001
NimbleGen Hybridization System 4	Roche Group	5223652001
NimbleGen Wash Buffer Kit	Roche Group	5223504001
X1 Mixers	Roche Group	5223725001