Summary
Gene microarrays são ferramentas poderosas no perfil de expressão gênica ao nível do genoma. Esta tecnologia tem aplicação em uma variedade de disciplinas biológicas, incluindo biologia do desenvolvimento e toxicologia. Neste vídeo, detalhamos um protocolo para análise global de expressão gênica utilizando uma plataforma de microarray abrangente de oligonucleotídeos para o peixe-zebra.
Abstract
Gene microarray tecnologia permite a medição quantitativa e perfil de expressão gênica dos níveis de transcrição em uma base de todo o genoma. Gene microarray tecnologia é utilizada em numerosas disciplinas biológicas em uma variedade de aplicações, incluindo análise global de expressão gênica em relação ao estágio de desenvolvimento, para um estado de doença, e em respostas tóxicas. Aqui, nós incluímos uma demonstração de análise global de expressão gênica utilizando um abrangente zebrafish específicos plataforma de microarranjos de oligonucleotídeos. O peixe-zebra plataforma de microarray expressão contém 385.000 sondas, 60 pares de bases de comprimento, interrogando 37.157 alvos com até 12 sondas por alvo. Para esta plataforma, todas as informações de cDNA e genômica disponível para o peixe-zebra foi coletado a partir de bases de dados genômicos diversos, incluindo Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC ( http://genome.ucsc.edu), e ZFIN (http://www.zfin.org). Como resultado dessa matriz de expressão fornece cobertura completa do transcriptoma zebrafish atual. O microarray expressão zebrafish foi impresso pela Roche NimbleGen (Madison, WI). Esta demonstração técnica inclui a marcação fluorescente de um produto cDNA, hibridação do produto marcado para a plataforma de cDNA microarray, e digitalização de matriz para a aquisição de sinal usando a estratégia de uma análise de cor.
Discussion
Protocolos microarray muitos, incluindo o detalhado aqui, use corantes fluorescentes como meio de medir e quantificar a hibridização. O corante fluorescente Cy3 é sensível a foto e degradação de ozônio. Recomenda-se que o procedimento seja realizado em uma iluminação mínima. Além disso, pequenas partículas de poeira pode interferir com a hibridação e digitalização. Especial atenção deve ser dada para garantir que a área de trabalho está limpo e livre de poeira.
Há muitas alternativas para o protocolo de rotulagem descritos neste procedimento. Recomenda-se que os protocolos de rotulagem vários ser testados para determinar o procedimento de rotulagem ideal para cada plataforma específica expressão microarray. O procedimento demonstrado aqui foi otimizado para esta plataforma específica expressão de matriz impressa pela Roche NimbleGen. Além disso, nós encontramos o protocolo de rotulagem detalhada no Guia do Usuário Roche Matriz NimbleGen para trabalhar tão bem. Recomenda-se precaução se a aplicação deste protocolo para plataformas outra expressão de matriz, especialmente a partir de outros fabricantes, como propriedades de hibridização são largamente governada pelos métodos de impressão da plataforma.
Acoplamento este protocolo variedade expressão a nosso isolamento do RNA e síntese de cDNA protocolo rotineiramente rendimentos reproduzíveis de alta qualidade genética de dados de expressão de matriz em nosso laboratório. Esta é uma meta importante para todas as análises série expressão em que a qualidade final dos dados é em última análise, depende da qualidade destes passos iniciais. Menos de ótimos resultados em qualquer uma dessas etapas que conduzem à análise final expressão matriz irá impedir a qualidade dos dados finais.
Os procedimentos apresentados neste vídeo a partir de fluorescência do cDNA para a aquisição de sinal é um procedimento padrão para análise de expressão de matriz independente da questão experimental. A direção na qual proceder para a análise da matriz de dados seguinte expressão de aquisição de imagem depende muito de cada experimento específico.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Array Microcentrifuge Dryer | ISC Bioexpress | C-1303-T | |
| BioPrime Array CGH Genomic Labeling System | Invitrogen | 18095-011 | |
| Cyanine 3-dCTP | PerkinElmer, Inc. | NEL576 | |
| GenePix 4000B | Molecular Devices | GENEPIX 4000B | |
| Microcon YM-30 | EMD Millipore | 42411 | |
| NimbleGen Array Processing Accessories | Roche Group | 5223539001 | |
| NimbleGen Hybridization Kit | Roche Group | 5223474001 | |
| NimbleGen Hybridization System 4 | Roche Group | 5223652001 | |
| NimbleGen Wash Buffer Kit | Roche Group | 5223504001 | |
| X1 Mixers | Roche Group | 5223725001 |
References
- BioPrime Array CGH Genomic Labeling System Manual. , Version C. (2004).
- Roche NimbleGen Arrays User's Guide for Gene Expression Analysis. , Version 3 (2008).
