細胞運動やゼブラフィッシュ胚における個々の神経細胞と神経堤細胞のアクチン細胞骨格のライブイメージング
Summary
このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の生体内で個々の神経細胞や神経堤細胞のイメージングを説明します。このメソッドは、蛍光共焦点タイムラプス顕微鏡を使用して細胞の行動とアクチンの局在を調べるために使用されます。
Abstract
ゼブラフィッシュは 、in vivo での開発時に画像セルの動作に最適なモデルです。ゼブラフィッシュの胚は外部から受精と開発のすべての段階でこのように簡単にアクセスされています。また、それらの光学的透明度はそのまま胚の自然環境における細胞と分子動力学の高分解能イメージングが可能になります。我々は、神経堤細胞の移動と神経軸索の伸長やガイダンス中の細胞の挙動を分析するライブイメージングの手法を使用しています。
ライブイメージングは、細胞運動のプロセスを制御するメカニズムを理解するために特に便利です。このような突出活動や分子動力学などの細胞の運動性の詳細を、可視化するために、それは個々の細胞を標識することが有利である。ゼブラフィッシュでは、プラスミドDNAの注入は一時的なモザイクの発現パターンが得られますし、他の細胞標識法に比べて明確な利点を提供しています。例えば、トランスジェニック系統は、多くの場合、全体の細胞集団をラベル付けするため、単セルの微細な突起（または分子の分布の変化）の視覚化を不明瞭にすることがあります。さらに、1細胞期でのDNAの注入は低侵襲と後の段階で染料を注射よりも正確です。
ここでは、個々の開発神経細胞や神経堤細胞とイメージング、in vivoでその動作を標識する方法を説明します。私たちは、モザイクのトランスジーン発現の結果1細胞期胚、中にプラスミドDNAを注入する。ベクトルは、その感覚神経細胞や神経堤細胞のサブセットに関心のある遺伝子のドライブの発現を細胞特異的プロモーターが含まれています。我々は、膜標的GFP、またはセル1を生体内でF -アクチンの可視化を可能にするバイオセンサープローブで標識された細胞の例を示します。
エリカアンデルセン、Namrata Asuri、そしてマシュークレイがこの作品にも同様に貢献した。
Protocol
Discussion
注入されたDNAの最適濃度は、構築と経験的に決定されるべきであるプロモーターの大きさと強さによって異なります。あまりにも多くのDNAの注入が少なすぎる遺伝子を発現注入胚の非常に小さな割合につながる一方、大規模な細胞死と不健康な胚につながることができます。 DNAの発現レベルは細胞から細胞へ変化する蛍光物質のシグナルの強さと相関する。落射蛍光下で胚をソートしながら…
Acknowledgements
この作品は、MCHオリンパスFV1000共焦点へNS042228がUW動物部（PIビルのBement）にNIHの共有の計測助成金S10RR023717で買収されたNIH R01によってサポートされていました。
エリカアンデルセン、Namrata Asuri、そしてマシュークレイはこの論文にも同様に貢献した。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | A5040-250G | ||
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 184 | ||
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen Inc. | 12243 | ||
| Low melting point agarose | Invitrogen | 15517-014 | ||
| Picospritzer | Parker Instrumentation, General Valve Division | 051-0302-900 |
References
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