Bu protokol zebrafish embriyolar yaşayan tek tek nöronların veya nöral krest hücreleri görüntüleme açıklar. Bu yöntem, floresan konfokal zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak cep davranışlar ve aktin lokalizasyonu incelemek için kullanılır.
Zebra balığı, in vivo geliştirme sırasında görüntüleme hücre davranışları için ideal bir model . Zebra balığı embriyolar dışarıdan döllenmiş ve gelişimin her aşamasında böylece kolayca ulaşılabilir. Ayrıca, doğal ortamda sağlam embriyonun hücre ve moleküler dinamiği yüksek çözünürlüklü görüntüleme, optik netlik sağlar. Biz nöral krest hücrelerinin göç ve nöron akson akıbet ve rehberlik sırasında hücre davranışlarını analiz etmek için canlı bir görüntüleme yaklaşımı kullanıyor.
Canlı görüntüleme, hücre hareketi süreçleri düzenleyen mekanizmalar anlamak için yararlıdır. Gibi çıkıntılı aktivite ve moleküler dinamik olarak hücre hareketi detayları, görselleştirmek için, tek tek hücrelerin etiketlemek için avantajlıdır. Zebra balığı, plazmid DNA enjeksiyonu, geçici bir mozaik ifade desenini verim ve diğer hücre etiketleme yöntemleri üzerinde farklı avantajlar sunuyor. Örneğin, transgenik çizgiler genellikle tüm hücre popülasyonlarının etiket ve böylece tek bir hücrenin ince çıkıntılar (veya moleküler dağılımında değişiklikler) görselleştirme gizleyebilir. Buna ek olarak, tek hücreli aşamada DNA enjeksiyonu, daha az invazif ve daha sonraki aşamada boya enjeksiyonu çok daha hassas.
Burada bireysel gelişmekte olan nöronların veya nöral krest hücreleri ve görüntüleme in vivo olarak davranışlarını etiketleme için bir yöntem açıklanmaktadır . Biz mozaik transgen ifadesi sonuçları 1-hücreli dönem embriyoların, plazmid DNA enjekte edilir. Vektörlerin hücre özel rehberleri içeren duyusal nöronların veya nöral krest hücrelerinin bir alt kümesi olan ilgi bir gen sürücü ifadesi. Biz membran hedef GFP ile veya canlı hücreleri 1 F-aktin görselleştirme sağlayan bir biyosensör probu ile işaretli hücrelerin örnekler sunuyor.
Erica Andersen, Namrata Asuri ve Matthew Kil, bu çalışmaya eşit katkıda bulundu.
DNA enjekte optimum konsantrasyon organizatörü büyüklüğü ve gücü oluşturmak ve ampirik olarak tespit edilmelidir bağlı olarak değişecektir. Transgen ifade enjekte embriyo çok küçük bir oranı çok az neden olurken çok fazla DNA enjeksiyonu, geniş hücre ölümü ile sağlıksız embriyolar yol açabilir. DNA ekspresyon seviyesi hücreden hücreye değişir fluorofor sinyal gücü ile ilişkilidir. Epifloresans altında embriyolar sıralama iken, son derece yüksek seviyede ifade olanlar dahil değild…
Bu çalışma NS042228 MCH Olympus FV1000 konfokal UW Zooloji Bölümü (PI Bill Bement) için bir NIH paylaşılan enstrümantasyon hibe S10RR023717 ile satın alındı R01 NIH tarafından desteklenmiştir.
Erica Andersen, Namrata Asuri ve Matthew Kil bu kağıt eşit katkıda bulunmuştur.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | A5040-250G | ||
Sylgard Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 184 | ||
QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen Inc. | 12243 | ||
Low melting point agarose | Invitrogen | 15517-014 | ||
Picospritzer | Parker Instrumentation, General Valve Division | 051-0302-900 |