Summary

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

Published: February 03, 2010
doi:

Summary

Bu protokol zebrafish embriyolar yaşayan tek tek nöronların veya nöral krest hücreleri görüntüleme açıklar. Bu yöntem, floresan konfokal zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak cep davranışlar ve aktin lokalizasyonu incelemek için kullanılır.

Abstract

Zebra balığı, in vivo geliştirme sırasında görüntüleme hücre davranışları için ideal bir model . Zebra balığı embriyolar dışarıdan döllenmiş ve gelişimin her aşamasında böylece kolayca ulaşılabilir. Ayrıca, doğal ortamda sağlam embriyonun hücre ve moleküler dinamiği yüksek çözünürlüklü görüntüleme, optik netlik sağlar. Biz nöral krest hücrelerinin göç ve nöron akson akıbet ve rehberlik sırasında hücre davranışlarını analiz etmek için canlı bir görüntüleme yaklaşımı kullanıyor.

Canlı görüntüleme, hücre hareketi süreçleri düzenleyen mekanizmalar anlamak için yararlıdır. Gibi çıkıntılı aktivite ve moleküler dinamik olarak hücre hareketi detayları, görselleştirmek için, tek tek hücrelerin etiketlemek için avantajlıdır. Zebra balığı, plazmid DNA enjeksiyonu, geçici bir mozaik ifade desenini verim ve diğer hücre etiketleme yöntemleri üzerinde farklı avantajlar sunuyor. Örneğin, transgenik çizgiler genellikle tüm hücre popülasyonlarının etiket ve böylece tek bir hücrenin ince çıkıntılar (veya moleküler dağılımında değişiklikler) görselleştirme gizleyebilir. Buna ek olarak, tek hücreli aşamada DNA enjeksiyonu, daha az invazif ve daha sonraki aşamada boya enjeksiyonu çok daha hassas.

Burada bireysel gelişmekte olan nöronların veya nöral krest hücreleri ve görüntüleme in vivo olarak davranışlarını etiketleme için bir yöntem açıklanmaktadır . Biz mozaik transgen ifadesi sonuçları 1-hücreli dönem embriyoların, plazmid DNA enjekte edilir. Vektörlerin hücre özel rehberleri içeren duyusal nöronların veya nöral krest hücrelerinin bir alt kümesi olan ilgi bir gen sürücü ifadesi. Biz membran hedef GFP ile veya canlı hücreleri 1 F-aktin görselleştirme sağlayan bir biyosensör probu ile işaretli hücrelerin örnekler sunuyor.

Erica Andersen, Namrata Asuri ve Matthew Kil, bu çalışmaya eşit katkıda bulundu.

Protocol

1. Enjeksiyon slaytlar ve görüntüleme slaytlar Meclisi Enjeksiyon slaytlar: Sylgard silikon elastomer üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. Bond üç standart cam mikroskop Sylgard kullanın kesiştiği uzun kenarları yan yana düzenlenmiş olan diğer iki slaytlar, üstüne bir slayt istifleme birlikte slaytlar. Üst slayt dik açılı bir köşesinde ya da üst ve alt slaytlar arasında "duvar" oluşturur. Sylgard gecede ayarlanmış olsun…

Discussion

DNA enjekte optimum konsantrasyon organizatörü büyüklüğü ve gücü oluşturmak ve ampirik olarak tespit edilmelidir bağlı olarak değişecektir. Transgen ifade enjekte embriyo çok küçük bir oranı çok az neden olurken çok fazla DNA enjeksiyonu, geniş hücre ölümü ile sağlıksız embriyolar yol açabilir. DNA ekspresyon seviyesi hücreden hücreye değişir fluorofor sinyal gücü ile ilişkilidir. Epifloresans altında embriyolar sıralama iken, son derece yüksek seviyede ifade olanlar dahil değild…

Acknowledgements

Bu çalışma NS042228 MCH Olympus FV1000 konfokal UW Zooloji Bölümü (PI Bill Bement) için bir NIH paylaşılan enstrümantasyon hibe S10RR023717 ile satın alındı ​​R01 NIH tarafından desteklenmiştir.

Erica Andersen, Namrata Asuri ve Matthew Kil bu kağıt eşit katkıda bulunmuştur.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)   Sigma A5040-250G  
Sylgard Silicone Elastomer Kit   Dow Corning Corporation 184  
QIAfilter Plasmid Midi Kit   Qiagen Inc. 12243  
Low melting point agarose   Invitrogen 15517-014  
Picospritzer   Parker Instrumentation, General Valve Division 051-0302-900  

References

  1. Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
  2. Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo. Mech Dev. 120, 211-218 (2003).
  3. Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
  4. Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones. Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).
  5. Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
  6. O’Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. 24, (2009).
  7. Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).

Play Video

Cite This Article
Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (36), e1726, doi:10.3791/1726 (2010).

View Video