Summary

Многоцветный проточной цитометрии Анализ клеточного иммунного ответа на резус-макак

Published: April 22, 2010
doi:

Summary

Мы демонстрируем полезность многоцветной проточной цитометрии для подробного фенотипические и функциональные характеристики от общего числа, а также памяти подмножеств CD4 + и CD8 + Т-клеток у макак-резус, идеальная модель для борьбы с ВИЧ / СПИД исследования вакцины.

Abstract

Резус-макаки модель в настоящее время наилучшие имеющиеся модели для ВИЧ-СПИД в отношении понимания патогенеза, а также для разработки вакцин и методов лечения<sup> 1,2,3</sup>. Здесь мы опишем метод подробную фенотипические и функциональный анализ клеточных иммунных реакций, в частности, внутриклеточное продукцию цитокинов CD4 + и CD8 + Т-клеток, а также отдельные подмножества памяти. Мы получили точные количественные и качественные показатели для производства гамма-интерферона (ИФН) и интерлейкин (IL) -2 в CD4 + и CD8 + Т-клеток от резус-макаки РВМС стимулированных PMA плюс иономицина (PMA + I). Цитокинов профили были различными в разных подмножествах ячеек памяти. Кроме того, данный протокол дает нам чувствительность, чтобы продемонстрировать даже незначительные доли антиген специфических CD4 + и CD8 + Т-клеток подмножества в РВМС образцы из макак-резус, иммунизированных пептидом ВИЧ конверт коктейль вакциной, разработанной в нашей лаборатории. Цитометрии многоцветной поток техника представляет собой мощный инструмент, чтобы точно определить различные популяции Т-клеток<sup> 4,5</sup> С цитокин-производственные мощности<sup> 6</sup> Следующий неспецифические или антиген-специфической стимуляции<sup> 5,7</sup>.

Protocol

Процедуры для подробного фенотипических и функциональных анализов от общего числа, а также памяти подмножества Т-клеток может быть разделена на четыре части: 1) подготовка клеток и антигенной стимуляции, 2) Поверхность маркер окрашивание, 3) внутриклеточные окрашивания цитокинов и 4) Пр?…

Acknowledgements

Доктор Прамод Nehete и миссис Bharti Nehete для макаки крови и РВМС образцов; Эта работа была частично поддержана за счет средств гранта NIH А.И. 46969, и все средства массовой информации культуре клеток были произведены Центральной Media Laboratory, которая финансируется за счет гранта NIH CA 16672.

Materials

Solution and Buffers

  • Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • RPMI-1640 medium (HyClone laboratories, Logan, UT)
  • Fetal Bovine Serum (FBS), (HyClone laboratories, Logan, UT)
  • L-glutamine (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
  • Penicillin/streptomycin (Invitrogen; Carlsbad, CA)
  • Trypan blue reagent (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
  • 50 mM Tris, PH 8.6; filtered and store at 4°C
  • Dulbecco’s PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life technologies, Rockville, MD)
  • Flow wash buffer: DPBS supplement with 2% FBS, store at 4°C
  • BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Biosciences; San Jose, CA)

Activation agents

  • Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • Ionomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • Costimulatory mAb CD49d, clone 9F10 (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • Affinity purified antibody F (ab )2 fragments of Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (Kierkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, MD)
  • Specific activation agents could include peptide pools, single peptide, or whole protein

Cytokine secretion inhibitors

  • Brefedin A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • Golgi Plug can be used alternatively (BD Biosciences; San Jose, CA)

Antibodies

  • Live/dead fixable aqua fluorescent stain kit (Invitrogen; Carlsbad, CA)
  • CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • CD4 pacific blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA)
  • CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • CD28 PerCP-cy5.5 (L293), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • CD95 APC (DX2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • IFN- FITC (B27), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences; San Jose, CA)

References

  1. Ogg, G. S. Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science. 279, 2103-2106 (1998).
  2. Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68, 6103-6110 (1994).
  3. Koup, R. A. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68, 4650-4655 (1994).
  4. Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque. Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).
  5. Pitcher, C. J. Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque. J Immunol. 168, 29-43 (2002).
  6. Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).
  7. Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes. J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).
  8. Gauduin, M. C. Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques. J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).
  9. Baumgarth, N., Roederer, M. A. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).
  10. De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 1. 1. -. c. o. l. o. r. 13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity. Nat Med. 7, 245-248 (2001).
  11. Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data. Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).

Play Video

Cite This Article
He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J. Vis. Exp. (38), e1743, doi:10.3791/1743 (2010).

View Video